Estrazione di glicosidi feniletanoidi da Cistanche tubulosa mediante taglio ad alta velocità Estrazione per omogeneizzazione

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Wenjing Pei e Ruili Guo

Sfondo:

Cistanche tubuloseè una nota medicina tradizionale cinese originaria dello Xinjiang. È ampiamente distribuito nell'Africa settentrionale, in India, ecc. Obiettivo: il principale componente bioattivo diC. tubulosaè glicosidi feniletanoidi (PhGs). L'echinacoside e l'acteoside sono i componenti indicativi per la determinazione dei PhG e sono utilizzati principalmente per la protezione del fegato, la protezione immunitaria, ecc. Pertanto, è molto importante estrarre i PhG da C. tubulosa. Metodi: in questo studio sono stati confrontati i metodi di estrazione assistita da ultrasuoni (UAE), estrazione assistita da microonde (MAE) ed estrazione di omogeneizzazione a taglio ad alta velocità (HSHE). Inoltre, sono state ottimizzate le condizioni di estrazione del metodo HSHE. Risultati: i risultati hanno mostrato che il metodo HSHE era migliore di entrambi i metodi UAE e MAE e i parametri di estrazione ottimali di HSHE erano una concentrazione di etanolo del 50 percento, una temperatura di estrazione di 70 gradi, una velocità di rotazione di 16000 rpm, un tempo di estrazione di 2 min, un rapporto solido-liquido di 1:9 e un ciclo di estrazione. Le rese di echinacoside e acteoside erano rispettivamente dell'1,366 e dello 0,519 percento e le velocità di trasferimento di echinacoside e acteoside hanno raggiunto rispettivamente l'87 e il 94 percento. Conclusioni: si può concludere che il metodo HSHE è una tecnica semplice, rapida ed efficiente per estrarre PhG da C. tubulosa. In evidenza: un metodo HSHE efficiente ed ecologico è stato studiato per l'estrazione di PhG da C. tubulosa. Sono state ottenute le condizioni ottimali del metodo HSHE per l'estrazione di PhG da C. tubulosa. Questa ricerca fornisce un nuovo metodo per l'estrazione industriale di PhG daC. tubulosa.

Cistanche tubulose

Cistanche tubuloseè una medicina tradizionale cinese comune che ha origine nello Xinjiang. È ampiamente distribuito nell'Africa settentrionale, nella penisola arabica, in Pakistan e in India ed è stato ufficialmente registrato nella Farmacopea cinese nel 2010. Il principale componente bioattivo diC. tubulosaè i glicosidi feniletanoidi (PhGs), una classe di prodotti naturali idrosolubili tra cui echinacoside, acteoside, isoacteoside e 2-acetylacteoside (1, 2). La struttura dei PhG è costituita da acido cinnamico e idrossifeniletilico, entrambi legati a un -glucopiranosio attraverso legami estere e glicosidici, rispettivamente (3). Studi farmacologici hanno dimostrato che i PhG di C. tubulosa hanno molte funzioni medicinali, come effetti antifatica (4), neuroprotettivi (5–7), protettivi del fegato (8–10) e immunoprotettivi (11). Pertanto, l'efficace estrazione di PhG da C. tubulosa è di grande importanza per lo sviluppo e l'utilizzo di prodotti naturali.

Gli attuali metodi di estrazione tradizionali dei PhG sono l'estrazione a riflusso, l'estrazione assistita da ultrasuoni (UAE) e l'estrazione assistita da microonde (MAE; 12-16). Questi metodi presentano diversi svantaggi, come bassa efficienza, lunghi tempi di estrazione e costi elevati. Rispetto ai metodi tradizionali, il metodo di estrazione per omogeneizzazione a taglio ad alta velocità (HSHE) è un nuovo metodo di estrazione emergente e presenta i vantaggi di tempi di estrazione più rapidi, meno rifiuti di solventi, rese più elevate, dispositivo più semplice e funzionamento più facile (17). Il principio di funzionamento del metodo HSHE si basa su una fresa interna rotante azionata da un motore ad alta velocità. Una potente forza di taglio viene prodotta dalle lame interne ed esterne per disgregare e mescolare i campioni. Nel frattempo, il cutter con rotazione ad alta velocità provoca differenze di pressione tra le cavità interna ed esterna del cutter, determinando un trasferimento di massa tra i campioni e i solventi. Con la combinazione di elevata forza di taglio, forza di collisione, pressione e altre forze, è possibile ottenere rapidamente un equilibrio solubile tra campioni solidi e solventi (18). Pertanto, il processo di estrazione di HSHE può essere completato in pochi minuti e anche rapidamente in decine di secondi (19-22).

Recentemente, HSHE è stato esplorato nell'estrazione di componenti bioattivi da vari prodotti naturali (23-25). Cheng et al. ha utilizzato HSHE per estrarre cinque lignani dal frutto di Schisandra Chinensis (26). I risultati hanno mostrato che le condizioni ottimali erano una concentrazione di etanolo del 75 percento, un tempo di estrazione di 1 minuto, un rapporto solido-liquido di 1:19, una tensione di estrazione di 180 V e una particella campione dimensione di 120 maglie. La resa totale dei cinque lignani era 13,89 ± 0,014 mg/g nelle condizioni ottimizzate. Tang et al. ha utilizzato HSHE per ottenere olio bioattivo dai semi di perilla (27). Le condizioni ottimali erano un tempo di estrazione di 2 min, un rapporto solido-liquido di 1:10, una tensione di estrazione di 150 V e due cicli di estrazione. La resa dell'olio di semi di perilla ha raggiunto il 59,3%. I risultati di cui sopra indicano che HSHE presenta i vantaggi di tempi di estrazione brevi, bassi costi e rese elevate. Tuttavia, c'è una mancanza di ricerca sull'estrazione di PhG da HSHE.

Nel presente studio, HSHE è stato utilizzato per esplorare la sua potenziale applicazione nell'estrazione di PhG daC. tubulosa. La resa di PhG è stata determinata mediante HPLC. I tre metodi di estrazione, HSHE, UAE e MAE, sono stati confrontati nelle stesse condizioni. Sono stati studiati gli effetti della concentrazione di etanolo, della temperatura di estrazione, della velocità di rotazione, del tempo di estrazione, del rapporto solido-liquido e del numero di cicli di estrazione della resa. I vantaggi e gli svantaggi di questo lavoro e dei riferimenti vengono confrontati e discussi.

Materiali e metodi

Materiali e reagenti chimici

C. tubulosaè stata acquistata da Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, Cina). Gli standard di echinacoside (purezza maggiore o uguale al 98 percento) e acteoside (purezza maggiore o uguale al 98 percento) sono stati acquistati da Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Shanghai, Cina). Acetonitrile, metanolo e acido acetico erano di grado HPLC (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). L'etanolo di grado analitico è stato acquistato da Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, Cina). L'acqua deionizzata è stata utilizzata durante gli esperimenti.

Analisi HPLC

Un'analisi HPLC è stata eseguita su una cromatografia liquida Waters e2695 (Waters, Milford, MA) dotata di un rivelatore UV/Visible 2489 e una colonna Symmetry C18 (Waters), 250 × 4,6 mm, dimensione delle particelle 5 μm. Le concentrazioni di echinacoside e acteoside sono state analizzate con il metodo HPLC. La fase mobile era costituita da (1) acetonitrile e (2) una soluzione acquosa di acido acetico glaciale al 2%. Il programma di eluizione del gradiente è presentato nella Tabella 1.

La lunghezza d'onda rilevata era di 330 nm, la portata era di 1 mL/min, il volume di iniezione era di 10 μL e la temperatura del forno era impostata a 30 gradi. Il picco cromatografico dell'analita è stato confermato confrontando il suo tempo di ritenzione con quello degli standard. La quantificazione è stata effettuata integrando il picco utilizzando un metodo standard esterno.

Il test di precisione è stato effettuato iniettando cinque volte gli stessi campioni di estrazione. Per il test di stabilità, gli stessi campioni sono stati analizzati con incrementi di 0, 1, 2, 4, 12, 24 e 48 h. I test di recupero dell'echinacoside e dell'acteoside sono stati effettuati aggiungendo gli standard ai campioni di estrazione. Sono state registrate tutte le aree di picco e i tempi di ritenzione di echinacoside e acteoside. I risultati delle curve di calibrazione per echinacoside e acteoside sono elencati nella Tabella 2.

Calcolo del rendimento

Echinacoside e acteoside sono stati utilizzati come componenti indicativi per la determinazione dei PhG. La resa di echinacoside o acteoside è stata calcolata utilizzando la seguente equazione:

S{0}}CV/W×100 percento (1)

dove Y=resa di echinacoside o acteoside ( percentuale ); C=concentrazioni di echinacoside o acteoside (mg/mL); V=volume della soluzione di estrazione (mL); e W=peso della polvere di C. tubulosa (mg).

Metodi di estrazione dei PhG

Gli steli di C. tubulosa sono stati prima macinati da una smerigliatrice elettrica (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Cina) e filtrati da un setaccio a filtro (circa 380 μm). Quindi, la polvere di C. tubulosa è stata essiccata in forno a 70 gradi fino a che il peso è stato costante. Cinque grammi di polvere di C. tubulosa sono stati mescolati con il solvente di estrazione e posti in una bottiglia di estrazione. Successivamente, la miscela liquida è stata preriscaldata (30–80 gradi) per 5 minuti in un bagno d'acqua a temperatura costante (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Cina).

(a) Metodo HSHE.—HSHE è stato eseguito da un sistema FA25 (FLUKO Co., Ltd, Shanghai, Cina), che consisteva nella fresa rotante, nel motore ad alta velocità e nel controller. La velocità di rotazione della fresa interna è stata regolata nell'intervallo 10000–28000 giri/min e i tempi di estrazione sono stati regolati nell'intervallo 2–15 min.

(b) Metodo degli Emirati Arabi Uniti. - Cinque grammi di campione essiccato e 300 ml di metanolo sono stati accuratamente pesati e aggiunti in una bottiglia di estrazione. La bottiglia di estrazione è stata immersa in un bagno ad ultrasuoni ed eseguita ad una potenza ultrasonica di 300 W per 10 min. La temperatura di estrazione è stata fissata a 30 gradi.

(c) Metodo MAE. - Cinque grammi di campione essiccato e 300 ml di metanolo sono stati accuratamente pesati e aggiunti in una bottiglia di estrazione. La bottiglia di estrazione è stata messa nel reattore a microonde e condotta a 180 W per 10 minuti. La temperatura di estrazione è stata fissata a 30 gradi.

Il metodo HSHE è stato confrontato con i metodi UAE e MAE con lo stesso solvente di estrazione, tempo di estrazione, temperatura di estrazione, rapporto solido-liquido e numero di ciclo di estrazione. La soluzione di estrazione è stata filtrata da una membrana 0.22 μm e analizzata tramite HPLC per determinare le concentrazioni di echinacoside e acteoside. Tutti i processi di estrazione sono stati ripetuti tre volte

Determinazione dei tassi di trasferimento

Sulla base del metodo standard della 2015 Farmacopea cinese, sono stati determinati i contenuti di echinacoside e acteoside nella polvere di C. tubulosa (28). Un grammo di polvere di C. tubulosa e 50 ml di metanolo al 50 percento sono stati accuratamente pesati e aggiunti in un matraccio tarato marrone da 50 ml. La miscela liquida è stata pesata e messa a bagno per 30 minuti. Quindi, il matraccio tarato marrone è stato immerso in un bagno ad ultrasuoni e condotto a una potenza ultrasonica di 250 W e una frequenza di 35 kHz per 40 minuti. La miscela liquida è stata ripesata ed è stato aggiunto il 50 percento di metanolo per fornire la perdita di solvente. La soluzione di estrazione è stata filtrata da una membrana da 0,22 μm ed è stata analizzata mediante HPLC per determinare le concentrazioni di echinacoside e acteoside. I processi di estrazione sono stati ripetuti tre volte.

Le velocità di trasferimento di echinacoside o acteoside sono state calcolate utilizzando la seguente equazione:

X= M1/M2 × 100 percento (2)

dove X=velocità di trasferimento di echinacoside o acteoside ( percentuale ); M1=qualità di echinacoside o acteoside nell'estratto (mg); e qualità M2=di echinacoside o acteoside in polvere di C. tubulosa (mg).

Risultati e discussione

Convalida del Metodo HPLC

I profili HPLC di echinacoside e acteoside di C. tubulosa utilizzando HSHE sono mostrati nella Figura 1. L'RSD delle aree di picco di echinacoside e acteoside era rispettivamente di 1,89 e 1,40 percento. I risultati hanno mostrato che il metodo HPLC ha una buona precisione nell'analisi quantitativa dell'echinacoside e dell'acteoside. In vari momenti (0–48 h), le RSD delle aree di picco di echinacoside e acteoside erano rispettivamente dell'1,71 e dell'1,70 percento, indicando che il campione era stabile in 48 h. Il recupero di echinacoside e acteoside è stato rispettivamente del 99,3 e del 99,1 percento e il loro RSD è stato rispettivamente dello 0,70 e dello 0,67 percento, il che ha confermato l'affidabilità del metodo HPLC.

Confronto dei diversi metodi di estrazione

È stato condotto un confronto del metodo HSHE con i metodi MAE ed UAE per quanto riguarda le rese di echinacoside e acteoside, i cui risultati sono mostrati in Figura 2. È stato osservato che le rese di echinacoside e acteoside ottenute da HSHE erano superiori a quelle ottenute sia dal MAE che dagli Emirati Arabi Uniti. Rispetto al MAE, le rese di echinacoside e acteoside ottenute da HSHE erano maggiori rispettivamente del 20,5 e del 20,8%. E rispetto agli Emirati Arabi Uniti, le rese di echinacoside e acteoside ottenute da HSHE sono state maggiori rispettivamente del 6,6 e del 7,4 percento. Questi risultati indicano che HSHE può aumentare significativamente le rese di PhG.

Ottimizzazione del metodo HSHE

I parametri di estrazione dei PhG mediante HSHE includono la concentrazione di etanolo, la temperatura di estrazione, la velocità di rotazione, il tempo di estrazione, il rapporto solido-liquido e il numero di cicli di estrazione (26, 29).

Effetto della concentrazione di etanolo sull'estrazione di PhG

La concentrazione di etanolo è un fattore importante che influenza le rese di PhG. Come mostrato nella Figura 3, sono state studiate le rese di echinacoside e acteoside da C. tubulosa a diverse concentrazioni di etanolo. Ha rivelato che la resa di echinacoside è aumentata dal 0 al 30 percento e poi è diminuita dal 30 al 90 percento con l'aumento delle concentrazioni di etanolo. La resa di acteoside è aumentata dallo 0 al 70 percento e quindi è diminuita dal 70 al 90 percento con l'aumento delle concentrazioni di etanolo. Quando la concentrazione di etanolo era del 50 percento, la somma delle rese di echinacoside e acteoside era al massimo. Le diverse concentrazioni di etanolo hanno polarità diverse, il che porta a diverse solubilità di echinacoside e acteoside. Pertanto, la concentrazione ottimale di etanolo era del 50 percento.

Effetto della velocità di rotazione sull'estrazione dei PhG

La figura 5 mostra gli effetti delle diverse velocità di rotazione sulle rese di PhG. Le rese di echinacoside e acteoside aumentavano con l'aumentare della velocità di rotazione. L'aumento della velocità di rotazione può aumentare la forza di taglio della fresa interna ed esterna, aumentando così le rese di PhG. La velocità di rotazione ottimale era di 16000 giri/min.

Effetto del tempo di estrazione sull'estrazione dei PhG

Le rese di echinacoside e acteoside nei diversi tempi di estrazione sono mostrate nella Figura 6. Le rese di echinacoside e acteoside erano stabili con l'aumento dei tempi di estrazione. Si può quindi concludere che i PhG possono essere estratti completamente da C. tubulosa in 2 minuti e il tempo di estrazione ottimale era di 2 minuti.

Effetto del rapporto solido-liquido sull'estrazione di PhG

Come mostrato nella Figura 7, sono state discusse le rese di echinacoside e acteoside nei diversi rapporti solido-liquido. Le rese di echinacoside e acteoside sono aumentate da 1:3 a 1:9 e sono diventate stabili da 1:9 a 1:24. Poiché una piccola quantità di solvente di estrazione non può dissolvere completamente echinacoside e acteoside, le velocità di trasferimento di massa sono state ridotte. L'eccessiva estrazione di solventi causava inutili sprechi. Pertanto, il rapporto solido-liquido ottimale era 1:9.

Effetto del numero di cicli di estrazione sull'estrazione di PhG

La figura 8 mostra che gli effetti di un certo numero di cicli di estrazione sulle rese di PhG. Le rese di echinacoside e acteoside aumentavano con l'aumentare del numero di cicli estrattivi. Tuttavia, i tempi di estrazione aumentavano notevolmente con l'aumento dei cicli di estrazione e veniva consumata più energia. Il numero ottimale di cicli di estrazione era uno.

Confronto del metodo HSHE con altri metodi di estrazione per l'estrazione di PhG

I risultati del metodo HSHE rispetto ad altri metodi di estrazione per l'estrazione di PhG da C. tubulosa sono elencati nella Tabella 3. HSHE è più semplice e facile dei metodi di accoppiamento come l'estrazione acquosa bifase assistita da ultrasuoni e la tecnologia di estrazione a microonde a ultrasuoni metodi. Inoltre, la pressione di estrazione di HSHE è inferiore rispetto al metodo di estrazione con liquido pressurizzato e le condizioni operative del primo sono più sicure. Ancora più importante, si può vedere dalla Tabella 3 che HSHE mostra il tempo di estrazione più breve e il minor consumo di solvente tra tutti i metodi di estrazione. Si può concludere che il metodo HSHE presenta molti vantaggi come alta efficienza, condizioni operative miti, bassi livelli di consumo, attrezzature semplici e facilità d'uso per l'estrazione di prodotti naturali.

Conclusioni

In questo studio, è stato studiato un metodo HSHE efficiente ed ecologico per l'estrazione di PhG da C. tubulosa. Rispetto ai metodi UAE e MAE, il nuovo metodo HSHE produce una resa maggiore di PhG nelle stesse condizioni. Rispetto al metodo MAE, le rese di echinacoside e acteoside sono state aumentate rispettivamente del 20,5 e del 20,8%. E rispetto agli Emirati Arabi Uniti, le rese di echinacoside e acteoside sono aumentate rispettivamente del 6,6 e del 7,4 percento. I parametri di estrazione di HSHE di PhG da C. tubulosa sono stati ottimizzati. In base ai parametri ottimizzati, le rese di echinacoside e acteoside hanno raggiunto rispettivamente l'1,366 e lo 0,519 percento e le velocità di trasferimento di echinacoside e acteoside hanno raggiunto rispettivamente l'87 e il 94 percento. Il metodo HSHE presenta i vantaggi di alta efficienza, condizioni operative miti, bassi livelli di consumo, attrezzatura semplice, funzionamento facile e costi contenuti. Questa ricerca fornisce un nuovo metodo per l'estrazione industriale di PhG da C. tubulosa.