Il tubuloside B della salsa di Cistanche salva le cellule neuronali PC12 dall'apoptosi indotta da ioni 1-metil-4- fenilpiridinio e dallo stress ossidativo

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Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Astratto:

Il neuroprotettivoeffetti del tubuloside B da cistanche, uno dei feniletanoidi isolati dai cinesierboristeria Cistanche salsa, sono stati studiati l'apoptosi indotta da 1-metil-4-fenilpiridinio ione (MPP plus ) e lo stress ossidativo nelle cellule neuronali PC12. Le cellule PC12 trattate con MPP ＋ hanno subito la morte per apoptosi come determinato dal test MTF, dalla citometria a flusso e dall'elettroforesi su gel di agarosio del DNA; l'accumulo intracellulare di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è stato misurato mediante colorazione DCFH-DA con microscopia confocale a scansione laser (LSCM). Trattamento simultaneo con il tuhuloside B MPP marcatamente attenuato＋ -citotossicità indotta, frammentazione del DNA e accumulo intracellulare di ROS. Questi risultati indicano fortemente che il tubuloside B previene l'apoptosi indotta da MPP e lo stress ossidativo. Il tubuloside B può essere applicato come anmorbo di Parkinsonagenti.

introduzione

Dal punto di vista patologico, la malattia di Parkinson sporadica (PD) è tipicamente caratterizzata da una perdita di neuroni catecolaminergici, in particolare neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta (SNc), e dalla presenza della caratteristica intraneurona| inclusioni chiamate corpi di Lewy nelle regioni cerebrali colpite. Nonostante una varietà di fattori siano stati implicati nella patogenesi del PD, i meccanismi coinvolti nell'inizio e nella progressione del PD rimangono incerti. Anche se la causa del PD rimane una risposta, diverse linee di evidenza suggeriscono fortemente il coinvolgimento dello stress ossidativo, portando infine alla morte neuronale o all'apoptosi per l'eccessiva generazione di radicali liberi [1], [2], [3]. Il fatto che il sistema dopaminergico nigrale possa produrre alti livelli di radicali liberi e abbia livelli relativamente bassi di sistema di difesa antiossidante supporta ulteriormente questa ipotesi. Sia gli studi in vivo che quelli in vitro hanno mostrato neurotossicità mediata dallo stress ossidativo dell'MPP＋, un metabolita attivo della l-metil-4-fenil-l,2,3,{9}}tetraidropiridina (MPTP) sui neuroni dopaminergici [4 ], [5]. Il coinvolgimento dei radicali liberi eccessivamente prodotti dallo stress ossidativo come causa prossima di disturbi neurodegenerativi come il PD suggerisce un ruolo fondamentale per gli antiossidanti. Il tubuloside B (Fig. l) era uno dei composti feniletanoidi isolati dagli steli diSalsa di cistanghe. Studi precedenti avevano scoperto che molti feniletanoidi, incluso il tubuloside B, mostravano una forte attività di scavenging dei radicali liberi [6], [7].

Considerando questi risultati, nel presente studio abbiamo studiato l'effetto del tubu]nside B sulla neurotossicità indotta da MPP plus in vitro, utilizzando la linea cellulare di feocromocitoma del nervo simpatico PC12 che è stata utilizzata con successo nel corso degli anni per studiare la funzione neuronale [8], [9].

morbo di Parkinson:cistance

Materiali e metodi

Materiali

Tubuloside B daSalsa di cistangheè stato gentilmente fornito dal Dr. Li Lei (Dipartimento di Prodotti Naturali, Scuola di Scienze Farmaceutiche, Università di Pechino, Pechino, Cina). La purezza del composto era superiore al 98 percento mediante analisi HPLC. Il mezzo di Eagle modificato (DMEM), il siero di cavallo e il siero di vitello fetale di Dulbecco sono stati acquistati da GIBCO BRL, 1- ione metil~-fenilpiridinio (MPP plus ), poli-L-lisina, 3-(4, 5 -dimetiltiazol-2 -il)-2,5- difeniltetrazolio bromuro (MTT), ioduro di propidio (PI), RNasi A, proteinasi K e 2;7'-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) sono stati acquistati da Sigma.

Coltura cellulare

Le cellule PCI2 sono state mantenute in DMEM integrate con 10 percento di siero di cavallo, 5 percento di siero di vitello fetale, 100 U/ml di penicillina e 100 ug/ml di streptomicina. Le cellule sono state coltivate in un incubatore umidificato aerato con il 95% di aria e il 5% di CO2 a 37 gradi. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti 24-48 h dopo la semina delle cellule. Le cellule sono state raccolte di routine mediante tripsinizzazione allo 0,25 percento quando le cellule si sono avvicinate allo stadio subconfluente e piastrate in flaconi di coltura da 25 cm divisi a 1: 8.

Analisi della vitalità cellulare

La vitalità cellulare è stata determinata utilizzando un test MTT modificato come descritto in precedenza [10], in breve, le cellule PC12 sono state seminate in 96-piastre a pozzetti a una densità di I × 104 ceil per pozzetto. Le colture sono state coltivate per 48 h, quindi il terreno è stato cambiato in quello contenente varie concentrazioni di tubulnside B o MPP＋. Dopo l'incubazione per un massimo di 48 ore e 72 ore, la soluzione MTr (5 mg/ml in DMEM) è stata aggiunta alle piastre a pozzetti 96- e le cellule sono state lasciate incubare per 4 ore a 37 gradi. Dopo che il mezzo è stato rimosso, la cellula e i cristalli di colorante sono stati solubilizzati aggiungendo 200μL di DMSO e l'assorbimento è stato misurato a 570 nm (540 nm come riferimento) con un lettore di micropiastre modello 550 (Bio-Rad). La vitalità cellulare è stata anche analizzata utilizzando il metodo di esclusione del trypan blue. Le cellule sono state raccolte, pellettizzate delicatamente e colorate con una soluzione allo 0,6% di blu trypan per 3 piogge. La percentuale di cellule non colorate è stata successivamente valutata in dieci campi di microscopio selezionati casualmente. Come farmaco positivo, è stato utilizzato un fattore di crescita epidermico (EGF) di 100 ng／ml.

Rilevazione dell'apoptosi mediante citometria a flusso

Le cellule apoptotiche sono state rilevate mediante citometria a flusso utilizzando ioduro di propidio (PI) [11]. In breve, circa 1 × 106 cellule incubate con le sostanze in esame sono state raccolte mediante centrifugazione e lavate una volta con PBS. Le cellule sono state fissate con 70 percento di etanolo per 24 ore a - 20 gradi e lavate una volta con PBS. Le cellule sono state quindi risospese in 300μL di PBS contenente 0,5 mg/ml di RNasi e 0,5 mg/ml di PI. Dopo un'ulteriore incubazione per 30 minuti al buio, la citometria a flusso è stata eseguita con un FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Germania).

Abbiamo applicato il protocollo di Moore [12] che isolava solo il DNA frammentato e gli esperimenti sono stati normalizzati utilizzando un numero uguale di colture da ciascun gruppo di test. In breve, 3 × 106 neuroni di ciascuno dei campioni trattati sono stati lavati nella soluzione salina bilanciata di Hank (1000g per 10 minuti) e i pellet formati sul fondo della provetta sono stati omogeneizzati con 1 ml di tampone di lisi (10 mM Tris a pH 7,4. 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) per 20 min su ghiaccio. Dopo centrifugazione a 11,000 g per 20 pioggia a 4 gradi, i supernatanti contenenti DNA frammentato sono stati rimossi e digeriti con 20 mg/ml di RNasi A a 37 gradi per 1 ora e 0,1 mg/ml di proteinasi K a 56 gradi per un ulteriore 1 h. Il DNA frammentato è stato estratto utilizzando fenolo e cloroformio e centrifugato a 1O,{33}}g per 1 pioggia a 4°C. La fase acquosa è stata trasferita in una nuova provetta Eppendorf, miscelata con 2 volumi di etanolo ghiacciato, quindi posto a-20 gradi per almeno 1 ora per precipitare il DNA. Dopo centrifugazione a 15,000g per 20 minuti a 4 gradi, i supernatanti sono stati rimossi e i pellet di DNA sono stati lavati con etanolo all'80% una volta (15.000 g per 15 minuti a 4 gradi), asciugati all'aria e sciolti in 20μL di TE tampone a pH 7,6. L'intero campione è stato quindi sottoposto a elettroforesi su un gel di agarosio all'1,5% per 1 ora a 85 V. Il gel è stato esaminato e fotografato da un sistema di documentazione del gel di prodotti a raggi ultravioletti (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Misurazione della formazione di ROS intracellulari

La formazione di perossidi intracellulari è stata rilevata con un microscopio laser a scansione confocale utilizzando un composto non fluorescente, 2"7"-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) [13], che è esterificato all'interno delle cellule dalle esterasi endogene all'acido libero ionizzato, 2 ;7"-diclorofluoresceina. 2",{10}}La diclorofiuorescina è in grado di essere ossidata a 2"7"-diclorofluoresceina (DCF) fluorescente dagli idroantiossidanti. Le cellule sono state incubate con 10 μM DCFH-DA per 30 minuti a 37 gradi. Le colture sono state lavate due volte con la soluzione salina bilanciata di Hank e riprese nello stesso mezzo. L'imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio laser a scansione confocale, DCF è stato eccitato a 488 nm e il filtro di emissione era un filtro barriera da 510 nm. Per fornire un confronto valido, sono stati utilizzati gli stessi parametri di acquisizione per tutte le osservazioni. È stata impostata la posizione verticale ottimale al centro delle celle, quindi il campo è stato rapidamente scansionato. Poiché l'illuminazione alla lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm ha causato un aumento della fluorescenza a causa dell'ossidazione di questo colorante, ogni campo è stato esposto alla luce esattamente per lo stesso tempo. I valori basali di cellule non stimolate sono stati utilizzati come valori di controllo per confrontare con cellule trattate con MPP in presenza o assenza di tubuloside B. Dopo la scansione, l'intensità media della fluorescenza relativa in 15-20 corpi cellulari neuronali per campo del microscopio è stata quantificata in quattro colture separate per condizione di trattamento.

cistance

analisi statistica

Tutti i valori ottenuti sono stati espressi come medie ±SD. La significatività statistica delle differenze tra i gruppi è stata determinata dal test t di Student; I valori p calcolati inferiori a 0.05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Risultati

Come mostrato in Fig. 2, MPP plus ha prodotto una diminuzione dose-dipendente della vitalità delle cellule PCI2. Al contrario, l'EGF, un noto fattore neurotrofico, ha prodotto una protezione significativa della vitalità cellulare a 100 ng/mL di MPP＋ gli effetti citotossici indotti sono stati attenuati anche in presenza di tubuloside B (5, 10, 50 o 100 ug-ml-1 ), sebbene con una potenza inferiore rispetto al farmaco di riferimento (Fig．3)． Il tubuloside B a queste concentrazioni ha mostrato effetti citoprotettivi in ​​modo dose-dipendente e il composto da solo non ha causato alcuna citotossicità apparente (dati non mostrati)． L'elettroforesi su gel dell'estratto di DNA da cellule PCI 2 trattate con 200 µM MPP plus per 48 h ha mostrato DNA laddering． un classico segno distintivo dell'apoptosi, il tubuloside B, a dosi di 10 e 100 μ g·ml-1 indotta dalla formazione della scala del DNA (Fig．4)．Fig．5 mostra gli istogrammi tipici dell'analisi citofluorimetrica della morte cellulare apoptotica indotta da MPP＋ nelle cellule PC12 in presenza o assenza di tubuloside B．La quantificazione del profilo del ciclo cellulare con PI ha rivelato il numero di ceil con caratteristiche subdiploidi (regione M1) indicative di frammentazione del DNA apoptotico． Nelle cellule non trattate, la frazione subdiploide apoptotica era minima fino a 5．94％del totale di 10000 cellule (Fig．5A)． Dopo 48 h di esposizione a MPP＋, la percentuale di apoptosi è aumentata a 43．02;j;(Fig．5 B)． Quando aggiunto alla coltura cellulare, il tubuloside B ha inibito l'MPP＋indotto l'apoptosi in modo dose-dipendente． A una concentrazione di 10 ug·ml-1la protezione da parte del tubuloside B non era statisticamente significativa, ma a 50 e 1 00ug·ml-1, una diminuzione del 45％e 63％rispettivamente, è stato osservato con conseguente aumento della percentuale di cellule di sopravvivenza (Fig．5D, E)．

L'accumulo di ROS intracellulare può essere rilevato mediante l'uso di DCFH-DA．Le cellule PC12 trattate con 200 uM MPP＋ per 48 ore hanno mostrato un'intensa fluorescenza all'interno della cellula dopo la colorazione con il colorante DCFH-DA (Fig．6)． Il trattamento simultaneo con tubuloside B (a dosi di 10 e 100 ug·ml.) ha inibito la produzione di ROS indotta da MPP＋一 (la percentuale ridotta era rispettivamente di 24．52％e 55．63％)．

Discussione

La patogenesi del PD comporta un forte stress ossidativo, ridotti livelli di antiossidanti e difetti mitocondriali． tutti noti per indurre l'apoptosi in diversi sistemi cellulari． In particolare, è stato dimostrato che i radicali liberi innescano la morte cellulare attiva nei neuroni[14]． MPTP produce una sindrome simil-parkinsoniana irreversibile e grave che causa la degenerazione selettiva dei neuroni dopaminergici nigrostriatali nell'uomo． Questa neurotossina è stata utilizzata per creare modelli animali di PD[15]．MPTP viene convertito dalla monoamino ossidasi B in MPP＋, che si accumula nei mitocondri． dove inibisce il complesso mitocondriale I e quei giorni mitocondriali． funzione provoca apoptosi[16]．Pertanto, la neurotossicità indotta da MPP più 一 nei neuroni dopaminergici è stata ampiamente utilizzata come modello eziologico di PD per lo screening di agenti neuroprotettivi．

Nel presente studio, abbiamo dimostrato che la morte cellulare indotta da MPP plus attraverso lo stress ossidativo nelle cellule PC12 è stata ridotta dal tubuloside B. Inoltre, abbiamo dimostrato che il tubuloside B proteggeva anche in modo dose-dipendente contro il laddering del DNA indotto da MPP plus e apoptosi, misurata mediante elettroforesi su gel di DNA e analisi citofluorimetrica. Inoltre, il trattamento simultaneo con concentrazioni più elevate di tubuloside B ha inibito la produzione di ROS indotta da MPP. Pertanto, il tubuloside B ha mostrato effetti neuroprotettivi multifunzionali. Diversi meccanismi, separatamente o in associazione, possono essere coinvolti nelle azioni del tubuloside B. L'effetto antiossidante è un possibile meccanismo di neuroprotezione mediata dal tubuloside B. Xiong Q ha scoperto che il tubuloside B ha mostrato una forte attività di scavenging dei radicali liberi sul radicale anionico superossido generato da 1,1-difenil-2-picrylidrazil e xantina]xantina ossidasi [6].

È stato recentemente riportato che diversi feniletanoidi possiedono proprietà di scavenging dei radicali liberi e proteggono le lesioni tossiche indotte dallo stress ossidativo. I ROS prodotti da MPP plus come il perossido di idrogeno, l'anione superossido e il radicale idrossile danneggiano prontamente le molecole biologiche, che alla fine possono portare alla morte cellulare apoptotica o necrotica. Pertanto, il tubuloside B può avere effetti di scavenging diretti contro i ROS. Sebbene i nostri dati non stabiliscano il sito esatto in cui il tubuloside B agisce per sopprimere l'accumulo di ROS, suggeriscono che il meccanismo neuroprotettivo coinvolge la stimolazione dei percorsi degli antiossidanti. Uno studio sulla struttura molecolare del tubuloside B indica anche che possiede una potente capacità di scavenging dei radicali liberi (comunicazione personale).

Potrebbero essere pertinenti anche altri meccanismi. Ad esempio, il tubuloside B può avere la capacità di contrastare la tossicità dell'MPP＋ inibendo l'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale e la disfunzione. Inoltre, dovrebbe essere considerato anche se il tubuloside B ha un effetto diretto sulla promozione della crescita sulle cellule neuronali. L'esatto meccanismo dell'azione neuroprotettiva del tubuloside B rimane poco chiaro. Sono necessari ulteriori studi per chiarire il quadro completo del suo effetto neuroprotettivo.

In conclusione, il tubuloside B dell'estratto di salsa di Cistanche ha evidenti effetti protettivi sull'apoptosi e sullo stress ossidativo indotti da MPP plus. I suoi effetti neuroprotettivi contro la tossicità da MPP ＋ potrebbero essere importanti e suggerire che potrebbe avere un potenziale terapeutico nella prevenzione e nel trattamento del PD.

trattamento del PD: cistanche

Riferimenti

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10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Caratterizzazione cinetica della tossicità dell'ossido nitrico per cellule PC12: effetto dell'emivita del rilascio di NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:{5}}

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