Come prevenire e ridurre la formazione di calcoli renali?

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Parte Ⅰ Ⅱ: Eversione della fosfatidilserina regolata dalla scramblasi fosfolipidica attivata dal TGF‑ 1/Segnalazione Smad nella fase iniziale della formazione di calcoli renali

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

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introduzione

L'urolitiasi è una delle malattie più comuni che colpiscono l'uomo ed è associata a molteplici complicanze urologiche [1]. Secondo quanto riferito, l'ossalato di calcio (CaOx) danneggia le cellule tubulari renali in coltura, dopo di che la fosfatidilserina (PS) della membrana cellulare si ribalta dallo strato interno allo strato esterno in vitro per svolgere ruoli importanti incalcolo renaleformazione [2]. Risultati simili sono stati riportati da vari studi [3-6]condotti a livello cellulare. Tuttavia, il meccanismo alla base dell'esternalizzazione del PS nelle cellule dei tubuli renali causato dal danno mediato da CaOx rimane poco chiaro. Precedenti studi hanno dimostrato che un'elevata concentrazione di ossalato di calcio porta alla sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) [7], che successivamente contribuisce all'esternalizzazione del PS nelle cellule dei tubuli renali per provocare la nucleazione e la crescita dei cristalli di CaOx [8]. I ROS e la perossidazione lipidica attivano fortemente la scramblasi fosfolipidica (PLSCR)[9], mentre l'esposizione a scavenger di ROS, come il glutatione, il coenzima Q10 o l'idebenone (un omologo sintetico del coenzima Q10), riduce l'attivazione del PLSCR nella malattia del rene policistico [10] . Il PLSCR, che è ancorato alla membrana cellulare[11], funziona come uno dei tre enzimi fosfolipidici capaci di catalizzare il rapido movimento bidirezionale del PS su entrambi i lati della membrana lungo un gradiente di concentrazione [12]. In condizioni fisiologiche, la membrana cellulare è in uno stato asimmetrico e il PLSCR non ha alcun effetto sulla membrana [13]. Tuttavia, a seguito della lesione delle cellule eucariotiche, il PLSCR viene attivato e sposta il PS dallo strato interno a quello esterno[14,15]. Inoltre, la sovraespressione delle cellule K1 dell'ovaio di criceto cinese PLSCRin stimola l'esternalizzazione del PS, migliorando il movimento verso l'esterno del PS verso la superficie cellulare durante l'apoptosi [16]. Pertanto, abbiamo ipotizzato che il PLSCR sia anche coinvolto nell'esternalizzazione del PS nella membrana cellulare del tubulo renale tramite l'attivazione di ROS.

Un potenziale meccanismo molecolare della produzione di ROS indotta da ossalato si verifica attraverso l'induzione della segnalazione di TGF- 1/Smad, che può svolgere un ruolo nella produzione di ROS [17,18]. In effetti, la segnalazione del TGF- 1/Smad è coinvolta in una miriade di malattie renali, come la glomerulonefrite, la fibrosi interstiziale renale e la nefrolitiasi[19]. Inoltre, le cellule mononucleate trattate con TGF- 1 mostrano PSesternalizzazione nella membrana cellulare provocando il ribaltamento di PS dallo strato interno a quello esterno [20]. Tuttavia, a nostra conoscenza, la relazione tra la segnalazione di TGF- 1/Smad e la PSeversione nelle membrane cellulari dei tubuli renali rimane sconosciuta. Abbiamo ipotizzato che il TGF- 1 partecipi all'eversione del PS nelle membrane cellulari dei tubuli renali attivando il PLSCR nella fase iniziale del rattocalcolo renaleformazione mediata da ROS.

Pertanto, abbiamo studiato se la segnalazione del TGF- 1/Smad stimola l'esternalizzazione del PS attraverso l'attivazione di ROS e se il TGF attiva il PLSCR nella membrana cellulare del tubulo renale durante la fase iniziale dicalcolo renalesviluppo in vitro e in vivo, ponendo così una base teorica per l'eziologia dicalcolo renaleformazione.

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Materiali e metodi

Modello di ratto di formazione di calcoli renali CaOx in fase iniziale

Sessanta topi Wistar maschi puliti di 3-mesi del peso di 200 ± 20 g sono stati forniti dal Centro sperimentale per animali dell'Università di medicina di Harbin e alloggiati a temperatura ambiente (22 gradi ± 2 gradi ) e 50-70 percento di umidità. Dopo 3 giorni di riproduzione adattativa, sono stati divisi casualmente in tre gruppi (20 ratti/gruppo): controllo,calcolo renale, ecalcolo renalepiù SB431542 (un inibitore della via di segnalazione del TGF- 1/Smad).

Calcolo renalela formazione inizia come un cambiamento patologico precoce dopo la lesione delle cellule tubulari renali [21,22]. Per studiare questo processo di lesione, un modello di ratto in fase inizialecalcolo renaleè stata stabilita la formazione, poiché non è stato ancora segnalato un approccio standardizzato. Per osservare i primi cambiamenti dopo la lesione delle cellule tubulari renali, abbiamo applicato il metodo riportato da Liet al. [23]. In breve, ai ratti nel gruppo di controllo sono stati somministrati 2 ml di acqua distillata al giorno tramite sonda gastrica, mentre ai ratti nel gruppocalcolo renaleal gruppo sono stati somministrati 2 ml di soluzione di glicole etilenico all'1% e una soluzione di NHCl all'1% al giorno tramite sonda gastrica. I topi nelcalcolo renalepiù il gruppo SB431542 sono stati iniettati per via intraperitoneale con SB431542 co-solvente (5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Shanghai, Cina) ogni 7 giorni [24]. Cibo e acqua sono stati forniti ad libitum. Il giorno 14, i ratti sono stati sottoposti a eutanasia mediante sovradosaggio di anestetico (pentobarbital sodico, 200 mg/kg, tramite iniezione intraperitoneale) e i loro reni sono stati asportati. I reni di sinistra sono stati immediatamente conservati in azoto liquido per la successiva rilevazione delle proteine. I reni di destra sono stati fissati, quindi disidratati e incorporati in cera di paraffina. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti secondo la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Le procedure sperimentali sono state approvate dall'Animal Experiment Use Ethics Committee del First Affiliated Hospital of Harbin Medical University (Numero di approvazione: 2020005, Harbin, Cina).

Formazione di cristalli nel tessuto renale

I campioni di tessuto sono stati colorati utilizzando il metodo Pizzolato [23] e i cristalli di CaOx sono stati osservati al microscopio ottico a luce polarizzata (Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, Cina). Le regioni Pizzolato-positive sono state misurate ed espresse come età permill dell'area totale dei tessuti delle sezioni trasversali utilizzando ImageJ 1.49v (National Institutes of Health, USA).

Rilevazione di PS nella membrana cellulare tubulare renale in vivo mediante citometria a flusso

L'esposizione al PS delle cellule epiteliali renali è stata valutata utilizzando un test di colorazione con annessina V marcato con isotiocianato di fluoresceina (FITC), come descritto in precedenza [2]. Le cellule sono state osservate (in ciascun gruppo) sotto un microscopio laser confocale (Olympus, Tokyo, Giappone). La quantità di esternalizzazione del PS è stata determinata come percentuale di cellule V positive all'annessina. La fluorescenza dell'annessina V dei campioni è stata misurata utilizzando un citometro a flusso (eccitazione a 488 nm/emissione a 530 nm; Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

Misurazione dei livelli di TGF- 1 e Smad7 nella membrana cellulare tubulare renale mediante western blotting

Dopo il recupero dei campioni di tessuto congelati, la proteina è stata estratta utilizzando il kit di estrazione proteica della membrana naturale ProteoExtract(M-PEK)(MERCK Co., Kenilworth, NJ, USA) e la concentrazione proteica è stata determinata utilizzando un saggio proteico Bio-Rad kit (Hercules, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, 40ug di proteine ​​sono stati caricati su un gel SDS-poliacrilammide all'8% (gel impilabile 100 V, gel risolvente 200 V) per 1 ora a una corrente costante dell'elettrodo di 300 mA. Le proteine ​​nel gel sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa (Kexing Co., Pechino, Cina), bloccate per 1 ora a 37 gradi in latte scremato in polvere al 5% e incubate per una notte a 4 gradi C con TGF 1 di pecora anti-ratto ( ab208466; Abcam, Cambridge, Regno Unito) e Smad7 (66.478; Proteintech, Wuhan, Cina) anticorpi [25]. È stato aggiunto un anticorpo secondario anti-pecora di coniglio marcato con perossidasi di rafano (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Pechino, Cina) e incubato a 37 gradi per 1 ora. Il segnale è stato rilevato utilizzando il reagente a chemiluminescenza potenziata (Abcam). Le bande positive sono state analizzate utilizzando il software di analisi della densità ottica del gel Gel-Pro 4.0 ed è stata misurata la densità ottica cumulativa (valore IOD), con il valore R che rappresenta il contenuto proteico relativo come segue: R=valore IOD di riferimento di PLSCR(target)/valore IOD di riferimento di GAPDH (proteina di riferimento).

Coltura cellulare e interferenza dell'RNA

Una linea cellulare epiteliale renale (cellule MDCK, CCL34, passaggi 53-90; ATCC, Manassas, VA, USA) è stata coltivata nel terreno Eagle modificato di Dulbecco integrato con antibiotici (10{{1{{14} }}} U/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) e 10 percento di siero bovino fetale (Life Technologies Co.) a 37 gradi in un 5 percento di CO, in atmosfera e in subcoltura con 0,25 percento tripsina e acido etilendiamminotetraacetico 1 mM (Life Technologies Co., CA, USA). Le cellule sono state trattate con CaOx (0,5 mM; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) per 2 ore e con CaOx 0,5 mM e 100 ug/mL di anticorpo neutralizzante anti-TGF- 1 (R&D Systems, Minneapolis , MN, USA) per 2 h. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.

Per determinare il ruolo dell'eversione della PS di PLSCRin, le cellule epiteliali tubulari renali sono state trasfettate con siRNA di PLSCR [26]. siRNA è stato progettato e sintetizzato dall'Anhui General Biological System (Anhui, Cina; vedere la tabella 1).LipofectamineTM 2000(Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Cina) è stato utilizzato per la trasfezione secondo le istruzioni del produttore . Dopo 24 ore di trasfezione, le cellule sono state digerite con tripsina, centrifugate a 1000 × g per 5 minuti, lavate due volte con PBS e centrifugate nuovamente. Il supernatante è stato scartato e il pellet è stato sospeso in PBS per formare una sospensione unicellulare di densità 1 × 10 cellule di grado/mL. Il tasso positivo di espressione di FAM (carbossifluoresceina) era del 93 percento ± 5 percento come determinato dalla citometria a flusso. Per valutare ulteriormente la relazione tra TGF 1 e PLSCR, le cellule sono state trattate con CaOx 0,5 mM o TGF 10 ng/mL- 1 per 2 ore e successivamente trasfettate con siRNA PLSCR.

Misurazione del livello di PLSCR nelle membrane cellulari tubulari renali mediante western blotting

La proteina è stata estratta utilizzando un kit di estrazione proteica di membrana naturale ProteoExtract (Chemical Book Co., Pechino, Cina) e la concentrazione proteica è stata determinata utilizzando un kit di analisi proteica Bio-Rad (Noble-Ryder Co., Pechino, Cina). Successivamente, 40 ug di proteine ​​sono stati caricati su un gel SDS-poliacrilammide all'8% (gel impilabile 100 V, gel risolvente 200 V) per 1 ora a una corrente costante di 300 mA. Le proteine ​​nel gel sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa (Kexing Co., Shenzhen, Cina) e bloccate con latte scremato al 5% per 1 ora a 37°C e incubate per una notte a 4 gradi con anticorpo monoclonale PLSCR di pecora anti-ratto (1:200, PAB781HuO1; Abcam, Guangzhou, Cina). È stato quindi aggiunto l'anticorpo secondario anti-pecora di coniglio marcato con perossidasi di rafano (1:400) e la miscela è stata incubata a 37°C per 1 ora. Dopo aver lavato la membrana, il segnale è stato rilevato con un reagente a chemiluminescenza potenziato (Abcam, Guangzhou, Cina). Le bande positive sono state analizzate utilizzando il software di analisi della densità ottica Gel-Pro 4.0gel ed è stato misurato il valore IOD, con il valore R che rappresenta il contenuto proteico relativo come descritto sopra.

Tabella 1 Sequenze siRNA per PLSCR

Misurazione della distribuzione della fosfatidilserina di membrana

La quantità di eversione PS della membrana cellulare è stata determinata utilizzando il metodo di spegnimento della fluorescenza descritto da Kim et al.[27] e il nostro team di ricerca [2], con nitrobenzene-2-oxa-1,3-diazolo (NBD, Shanghai, Cina) come sonda di fluorescenza. Dopo aver etichettato il PS nello strato esterno della membrana cellulare con NBD, le cellule sono state coltivate in PBS contenente diisopropilfluorofosfato 5 mM. Successivamente, è stato aggiunto PBS contenente ossalato di calcio (1.{7}} mM) e le cellule sono state incubate a 37 gradi. Una quantità uguale di sospensione cellulare è stata scaricata ogni 10 minuti e l'intensità della fluorescenza è stata registrata utilizzando uno spettrofluorimetro RF-5000 (Shimadzu, Kyoto, Giappone). Le impostazioni dello spettrofluorimetro erano le seguenti: larghezza della fenditura di 10 nm per una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm; e larghezza della fenditura di 5 nm per una lunghezza d'onda di eccitazione di 470 nm. Successivamente, il valore medio di fluorescenza (FT) è stato registrato negli anni '50. L'intensità media di fluorescenza ridotta (FD) è stata registrata anche dopo aver utilizzato una soluzione di ditionite per estinguere la fluorescenza NBD dallo strato esterno della cellula. Successivamente, è stato aggiunto l'1% (p/v) di Triton X-100 per permeabilizzare la membrana cellulare. La fluorescenza NBD dallo strato interno della membrana cellulare è stata quindi spenta ed è stata registrata l'intensità di fluorescenza (FO). La percentuale di NBD-PS nei lobuli interni è stata successivamente calcolata utilizzando la seguente equazione: età percentuale di NBD-PS interiorizzato=100×[(FD-FO)/(FT-FO)].

La percentuale di esternalizzazione PS è stata determinata secondo il principio utilizzato per la misurazione dell'internalizzazione NBD-PS. La percentuale di NBD-PS nei lobuli esterni è stata calcolata anche utilizzando la seguente equazione: percentuale di NBD-PS nei lobuli esterni=100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

analisi statistica

Le variabili continue sono espresse come media ± deviazione standard. Sono stati utilizzati un test rank-sum accoppiato non parametrico, t-test e test chi-quadrato. Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando il software SPSS 19.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Risultati con P<0.05 were="" considered="" statistically="">

Risultati

La segnalazione TGF- 1/Smad stimola l'esternalizzazione del PS in vivo

Formazione di cristalli nel tessuto renale del modello di ratto

Per stabilire un modello di ratto di fase inizialecalcolo renaleformazione, glicole etilenico e cloruro di ammonio sono stati somministrati allo stomaco dei ratti per 2 settimane, quindi ciascuna sezione renale è stata esaminata con un microscopio digitale. Nei campioni del gruppo di controllo, sono state osservate strutture tubulari renali normali senza formazione di cristalli il giorno 14 (Fig. 1A). Quando il tessuto renale dalcalcolo renalegruppo è stato osservato al microscopio, i tubuli renali apparivano dilatati con microcristalli visibili; accumulo occasionale di cristalli di CaOx è stato osservato in alcuni tubuli renali, indicando la riuscita creazione di un modello di ratto di stadio inizialecalcolo renaleformazione e la generazione di danno cellulare del tubulo renale.

Presenza di PS nella membrana cellulare tubulare renale

L'annessina V-FITC, una molecola fluorescente che si lega al PS sulla superficie cellulare, è ampiamente utilizzata per rilevare la ridistribuzione del PS. Nel nostro studio, le cellule MDCK nel controllo normale,calcolo renale, ecalcolo renalepiù gruppi SB431542 sono stati osservati al microscopio laser confocale (Fig.1B). Il tasso di eversione PS è aumentato nelcalcolo renalegruppo confrontato con quello del gruppo di controllo (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">calcolo renalepiù il gruppo SB431542 ha mostrato un livello basale di esternalizzazione PS inferiore rispetto a quelli delrenecalcologruppo (pag<0.05, fig.="" 1c,="">

Misurazione dei livelli di TGF- 1 e Smad7

Il livello TGF- 1 nelcalcolo renalegruppo è stato quantificato mediante western blotting. Un tipico western blot è mostrato in Fig.2A insieme all'analisi densitometrica del livello di TGF- 1. I valori sono stati normalizzati a quelli del controllo ed espressi come rapporto tra TGF- 1 e tubulina. L'aggiunta di glicole etilenico e NH Cl ha aumentato significativamente il livello di TGF- 1 e ha ridotto il livello di Smad7 rispetto a quelli nelle cellule di controllo (Fig.2A); tuttavia, il trattamento con SB431542 più glicole etilenico e NH Chiamato per ridurre significativamente il livello di TGF- 1 e aumentare il livello di Smad7 rispetto a quelli in cellule trattate con glicole etilenico e NH, Cl.

Il TGF attiva l'attività del PLSCR nella membrana cellulare del tubulo renale in vitro

PLSCR

Il livello di PLSCR è stato valutato mediante western blotting. Le cellule sono state trattate con CaOx per 2 ore. Il livello di PLSCR era trascurabile nelle cellule di controllo ma aumentava significativamente nel gruppo CaOx (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Movimento verso l'interno NBD-PS alterato

Abbiamo determinato i movimenti verso l'interno e verso l'esterno di PS nella membrana delle cellule epiteliali tubulari renali per valutare l'attività del PLSCR. Per valutare se il PLSCR influenza il movimento di PS dal lembo esterno al lembo interno della membrana plasmatica, abbiamo integrato il PS marcato in modo fluorescente (NBD-PS) nel lembo esterno della membrana plasmatica e ne abbiamo monitorato l'interiorizzazione (Fig.3). La quantità di NBD-PS interiorizzata dalle cellule MDCK nei gruppi di controllo e CaOx era rispettivamente del 46,2% e del 17,8% circa. Quindi, il tasso di interiorizzazione del PS nelle cellule del gruppo CaOx era significativamente inferiore a quello delle cellule del gruppo di controllo (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

Fig. 1 La formazione di cristalli e l'esternalizzazione di PS sono state osservate nei gruppi di controllo, calcolo renale e calcolo renale più SB431542.

(A) Formazione di cristalli nel tessuto renale il giorno 14; la freccia indica le strutture microcristalline. (B) Le cellule MDCK sono state osservate mediante microscopia laser confocale.

(C) Grafici citometrici di flusso del tasso di eversione. (D) Tasso di eversione (percentuale). Il triangolo indica P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">calcolo renalegruppo

Movimento verso l'esterno NBD‑PS migliorato

Per determinare se il trasporto verso l'esterno del PS è influenzato dall'ossalato, le cellule MDCK sono state etichettate a livello intracellulare con NBD-PS ed è stata determinata l'entità del suo movimento verso il foglio illustrativo degli esempi. Il mezzo di incubazione conteneva albumina di siero bovino (1% p/v), che estraeva rapidamente NBD-PS espresso in superficie. Circa il 34,5% di NBD-PS è migrato al lembo esterno nelle cellule di controllo, mentre il tasso di trasferimento di PS verso l'esterno nelle cellule del gruppo CaOx è stato aumentato al 75,3% rispetto a quello del totale NBD-PS interno etichettato, che era significativamente maggiore di che nelle celle del gruppo di controllo (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

Fig.2 Espressione di TGF- 1/Smad nei gruppi di controllo, calcolosi renale e calcolosi renale più SB431542 ed espressione di PLSCR nella membrana cellulare del tubulo renale.

(A)TGF- 1/espressione Smad. (B) Livelli relativi di scramblasi fosfolipidica (PLSCR) e macchia rappresentativa con espressione normalizzata a quella di GAPDH.P<>

Il triangolo indica P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

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