Screening della densitometria HPTLC e identificazione di massa della contaminazione da agenti sbiancanti fluorescenti nella farina di cereali

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yisheng Chen1,2 e Caihong Huang1,2 e Xueming Xu

Astratto

Negli ultimi anni, sono emerse crescenti preoccupazioni sui problemi di sicurezza alimentare associatiagenti sbiancanti fluorescentidai materiali di imballaggio. Qui, abbiamo riportato lo sviluppo di un metodo facile e affidabile adatto per la quantificazione e l'identificazione ad alto rendimento di due comuni agenti sbiancanti fluorescenti (FWA 184 e FWA 367) nei prodotti a base di cereali (farina di grano e di riso), con piattaforma ad alte prestazioni thin- cromatografia a strati. In primo luogo, la preparazione e la pulizia del campione sono state eseguite rapidamente tramite un'estrazione solido-liquido ottimizzata. Gli estratti e lo standard di riferimento sono stati simultaneamente separati su piastre di gel di silice, utilizzando la miscela di toluene e acetato di etile (10/0,3, v/v) come fase mobile. Quindi, la quantificazione rapida è stata eseguita con densitometria in modalità fluorescente (365HPTLCpoiché una piattaforma analitica versatile può raggiungere un equilibrio ideale tra produttività, semplicità e rilevabilità, quindi, particolarmente adatta per l'analisi degli alimenti orientata allo schermo.

Parole chiave HPTLC. Densitometria.Sbiancanti fluorescenti

Cistanche ha un effetto sbiancante sulla pelle

introduzione

Negli ultimi anni si è assistito al boom dei materiali per imballaggi alimentari. D'altra parte, anche i problemi di sicurezza alimentare associati al materiale dell'imballaggio hanno attirato l'attenzione di tutto il mondo. Tra le sostanze chimiche pericolose che potrebbero derivare da questi materiali,agenti sbiancanti fluorescenti(FWA) hanno riscosso un interesse particolarmente elevato. Le molecole di FWA erano in grado di assorbire radiazioni e contemporaneamente emettere luci visibili. Tale trasformazione può compensare il colore giallo delle sostanze, con conseguente impressione di bianco intensificato. In quanto tali, i materiali incorporati con gli FWA sono stati presi in considerazione in modo intensivo per i pacchetti alimentari. Soprattutto per i prodotti a base di cereali, tale pacchetto è stato utilizzato favorevolmente per aumentare l'attrattiva e l'accettazione dei consumatori. Ad esempio, livelli anormalmente elevati diFWAera stato trovato nel cartone di popcorn e spaghetti istantanei (Jiang et al. 2015). Di conseguenza, gli FWA sono migrati negli alimenti a base di cereali e hanno provocato la contaminazione, ponendo una sfida emergente per la salute pubblica.

Decenni fa, la stabilità straordinariamente elevata diFWAavevano suscitato forti preoccupazioni sulla loro potenziale tossicità. Sebbene il reale impatto degli FWA sulla salute umana non fosse ancora conclusivo, la loro tossicità sullo sviluppo e l'effetto di alterazione dell'espressione genica negli animali modello erano stati evidenziati sperimentalmente (Belliveau et al. 1990; Jung et al. 2012) .Riguardo a questi potenziali rischi, le autorità per la sicurezza alimentare di tutto il mondo hanno stabilito restrizioni e limiti agli FWA migrabili nei materiali a contatto con gli alimenti.

Con l'obiettivo di implementare questi standard legislativi, è stata proposta un'ampia gamma di metodi analitici, principalmente ispezione a fluorescenza UV o cromatografia su colonna (HPLC ed elettroforesi capillare), per il rilevamento di FWA (Jiang et al. 2015; Wu et al. 2018) . Ma dal punto di vista della pratica, tutti questi metodi esistenti non erano adattati al principio di uno screening affidabile e conveniente. Ad esempio, il metodo di ispezione con fluorescenza UV ha risentito notevolmente della scarsa selettività. Nel frattempo, l'analisi basata su sistemi cromatografici su colonna ha mostrato una notevole carenza di semplicità ed efficienza in termini di costi. Al contrario, la cromatografia su strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC) stava aprendo un nuovo orizzonte della metodologia di screening degli alimenti. Molti metodi orientati allo screening basati suHPTLCera stato sviluppato e applicato nell'analisi di vari componenti alimentari, mostrando una flessibilità senza precedenti mentre idealmente colmava il divario tra l'aspetto di semplicità, specificità e affidabilità (Galarce-Bustos et al. 2019; Li et al. 2018; Mikropoulou et al. 2019 ; Pedan et al. 2018; Premarathneet al. 2018; Stanek et al. 2019; Sun et al. 2018). In questo modo, molti campioni (fino a 40) possono essere analizzati contemporaneamente con una tolleranza della matrice quasi illimitata, poiché ciascuna delle piastre era usa e getta (Li et al. 2019). Ciò implicava che la richiesta di pulizia del campione e manutenzione dello strumento poteva essere notevolmente risparmiata. Come applicazione all'ispezione visiva, la densitometria ha consentito una misurazione precisa e accurata dei risultati di separazione sulla piastra HPTLC (Lebot et al. 2020). Con il rapido sviluppo delle tecnologie di sillabazione, il merito più caratteristico di HPTLC è stato che può essere utilizzato come piattaforma per assemblare in modo efficiente l'usabilità di potenti strumenti analitici, come la spettroscopia Raman con superficie migliorata (Kang et al. 2019; Qu et al. 2018; Wang et al. 2018a, b), biosensore (AgatonovicKustrin et al. 2020; Chen et al. 2020a, b; Choma e Grzelak2011; Galarce-Bustos et al. 2019), analisi immagine/chemiometrica (Rejšek et al. 2016; Xu e Liu 2021; Xu et al. 2019) e rilevamento di massa (Wang et al. 2018a, b). In quanto tale, HPTLC era stato una cassetta degli attrezzi versatile particolarmente adatta per le attività di screening.

In questo contesto, l'obiettivo di questo lavoro era quello di sviluppare un metodo di screening facile e sensibile per FWAsin diversi campioni di farina di cereali, basato sulla combinazione diHPTLC, densitometria fluorescente (FLD) e spettrometria di massa (MS). Dopo lo sviluppo del metodo, le sue prestazioni sono state convalidate sia quantitativamente che qualitativamente, evidenziando sostanzialmente la sua reale superiorità come strumento facile per lo screening.

Materiali e metodi

Materiali

Standards of FWA184 (2,5-bis(5′-tert-butyl-2-benzoxazolyl) thiophene, CAS 7128-64-5, > 99% purity) and FWA367 (1,4-bis(2-benzoxazolyl) napthalene, CAS 5089-22-5, >98 per cento di purezza) sono stati acquistati da Aladdin (Shanghai, Cina). I solventi organici e le sostanze chimiche di grado analitico provenivano da Sigma Aldrich (Shanghai, Cina). Le lastre di gel di silice60 F254 (grado analitico, spessore dello strato 0,1 mm, dimensioni 10 × 20 cm, numero di serie 1.05729.0001) provenivano da Merck (Darmstadt, Germania). Sei campioni di cereali in bianco, inclusi tre campioni di farina di frumento e tre campioni di farina di riso, sono stati acquistati nel supermercato locale. A parte questo, campioni di farina di frumento e riso con contaminazione FWA confermata sono stati forniti dallo Shenzhen Customs Food Center.

estratto di cistanche tubulosa

Soluzioni standard

Le soluzioni madre ({{0}}.01 mg/mL) di FWA 184 e FWA 367 sono state preparate in acetato di etile, separatamente o nella miscela, e conservate in frigorifero (4 gradi). Le soluzioni di lavoro per stabilire le curve di calibrazione sono state preparate diluendo ulteriormente le soluzioni di scorta a 0,0001 mg/mL.

Preparazione del campione

Per estrarre analiti da campioni di cereali, acetato di etile,acetone e loro miscele (rapporto di miscelazione, v/v, 10/{6}}, 6/4, 4/6 e 0 /10) sono stati testati come solvente di estrazione. In breve, un campione di farina di cereali da 5 g è stato miscelato con 20 mL di solvente di estrazione; se necessario, 100 o 50 μL di soluzioni madre (0,01 mg/mL) di standard FWA sono stati aggiunti alla miscela di estrazione di campioni in bianco, ottenendo 200 o 100 ug/kg di artificiale contaminazione. Dopo il trattamento di un bagno ad ultrasuoni a 30 gradi per 5 minuti, la sospensione è stata separata mediante centrifugazione per 5 minuti a 4 gradi. Successivamente, 1 ml di supernatante è stato accuratamente pipettato in una siringa da 5 ml e filtrato attraverso una membrana di nylon da 0.45-μm per rimuovere le particelle solide ed evitare il blocco dell'ago.

Passi HPTLC

Gli estratti del campione e gli standard di riferimento sono stati spruzzati come bande di 6-mmHPTLCpiastre da un campionatore semiautomatico Linomat 5 (CAMAG, Svizzera) dotato di una siringa di 100-μL, alla velocità di erogazione di 100 nL/s e 0,2 μL pre-dosaggio. L'array di bande era inizialmente a 15 mm dal bordo sinistro e 10 mm dal basso, con l'intervallo calcolato automaticamente l'uno dall'altro. I volumi di applicazione erano 10 μL per estratti di campioni vuoti e addizionati; per stabilire la curva di calibrazione, sono stati applicati 1, 5, 10, 15 o 20 μL di soluzione di lavoro (0,0001 mg/mL), risultando in concentrazioni di gradiente rispettivamente a 100, 500, 1000, 1500 e 2000 pg/banda. campionamento, la siringa è stata risciacquata manualmente con acetato di etile puro due volte tra ogni applicazione per prevenire la contaminazione incrociata. Dopo l'applicazione, la piastra è stata riscaldata da un riscaldatore per TLC III (CAMAG, Svizzera) a 60 gradi per 2 minuti per rimuovere i residui di solvente nelle bande di applicazione. La cromatografia è stata eseguita automaticamente con ADC-2(CAMAG, Svizzera), al fine di realizzare una separazione riproducibile. Innanzitutto, entrambe le trincee della camera di sviluppo sono state riempite con una fase stazionaria costituita da 10 ml di toluene e 0,3 ml di acetato di etile. Prima di immergere il fondo della piastra nella fase mobile, è stato effettuato un controllo della secchezza di 5 minuti facendo gorgogliare attraverso una soluzione acquosa satura di MgCl2 fino a un'umidità relativa finale al 33 percento, 10 minuti di saturazione del serbatoio e 10 minuti di precondizione della piastra. La distanza di migrazione della linea anteriore del solvente è stata fissata a 50 mm.

Documentazione su piastra e densitometria

Dopo lo sviluppo, le immagini digitali della lastra sviluppata sono state documentate da un sistema di imaging DD70 (Biostep, Germania) integrato con una fotocamera digitale Sony EOS7{11}}D illuminata da lampade UV a 366 nm. Quindi, i risultati della separazione sono stati valutati densitometricamente da uno scanner TLC 3 (CAMAG, Svizzera). Per individuare la lunghezza d'onda di lavoro della densitometria, gli spettri di eccitazione dell'analita depositato sulla piastra di gel di silice sono stati profilati continuamente da 220-400 nm utilizzando la lampada D2 & W, con filtro ottico K400. La scansione quantitativa è stata eseguita con impostazioni generali: modalità fluorescente, lampada al mercurio, lunghezza d'onda di eccitazione 365 nm, filtro ottico K400, dimensione della micro-fessura 3,00 × 0,30 mm, velocità di scansione 100 μm/s e risoluzione dei dati 100 μm/passo. Il funzionamento strumentale e l'elaborazione dei dati sono stati controllati dal software thewinCATS versione 1.4.4.

beneficio diestratto di cistanche tubulosa

HPTLC-MS

Dopo le misurazioni FLD, le bande positive sono state ulteriormente identificate dalle loro impronte digitali MS, mediate da un'interfaccia TLC-MS (CAMAG). Guidate da una pompa quaternaria, le bande mirate visualizzate con illuminazione a 366 nm sono state eluite con un flusso di acetonitrile contenente 0,1 percento di acido formico, alla velocità di 0,2 mL/min per 60 secondi. Direttamente, l'eluente è stato iniettato in una sorgente di elettrosprayionizzazione e simultaneamente analizzato da uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (Quattro Premier XE, Waters). L'acquisizione dei dati MS full-scan è stata eseguita in modalità ESI plus con le seguenti impostazioni: le tensioni capillari sono 3,5 kV, le tensioni del cono sono 50 V, la temperatura della sorgente ionica 100 gradi, la temperatura di desolvatazione 400 gradi, la portata del gas di desolvatazione 700 L/h e cono gas portata 50 L/h. Gli spettri sono stati registrati negli intervalli di 50–1000 m/z.

Risultati e discussione

Ottimizzazione della cromatografia

Per quanto riguarda la bassa polarità dei composti target, l'ottimizzazione della fase mobile è stata avviata con prove di prova con diversi solventi idrofobici (tra cui acetone, toluene, esano e etere di petrolio) e loro miscele. Dallo screening iniziale, è stato riscontrato che il toluene da solo fornisce una risoluzione sufficiente dei composti mirati dalle matrici di campionamento interferenti che per lo più sono rimaste nella parte inferiore della traccia. Per aumentare ulteriormente la risoluzione degli analiti, sono state aggiunte diverse quantità (1–10 percento) di acetato di etile. Dal confronto, viene attribuito al fragile equilibrio tra la fase mobile (liquida), l'atmosfera della camera (gas) e la fase stazionaria (solida). In altre parole, l'equilibrio di fase verrebbe interrotto quando la piastra fosse spostata manualmente. Ciò ha fortemente evidenziato l'importanza della strumentazione per la ripetibilità diHPTLCanalisi. Inoltre, l'applicabilità delle condizioni di separazione ottimizzate è stata ulteriormente valutata analizzando campioni di cereali contaminati artificialmente, dalla Fig. 1a si può concludere che la presenza di matrici di campioni non ha portato a variazioni significative dei risultati cromatografici. Pertanto, toluene/acetato di etile (10/0,3, v/v) è stato fissato come fase mobile durante questo lavoro.

Screening visivo e quantificazione FLD

L'acquisizione dell'immagine dell'intera lastra era uno dei vantaggi diHPTLC, con il quale è possibile ottenere facilmente un profilo semiquantitativo di separazione mediante ispezione visiva. Qui, l'intensa fluorescenza nativa degli analiti ha consentito la lettura diretta dei risultati cromatografici sotto irradiazione a 366 nm, con sensibilità fino a 100 pg/banda. Successivamente, solo il confronto orizzontale tra le tracce potrebbe portare a una stima diretta del grado di contaminazione del campione, che è stato molto favorito nelle attività di screening. Inoltre, è stata impiegata la densitometria nella modalità di fluorescenza per eseguire la scansione delle tracce. Anche questo passaggio è stato molto efficiente, che può essere terminato in 2-3 minuti. Con l'intenzione di identificare la lunghezza d'onda di eccitazione ottimale per la densitometria, è stato studiato lo spettro di eccitazione (220–400 nm) dell'analita depositato sullo strato di gel di silice. Come presentato in Fig. 1b, i profili spettrali dell'analita in diverse condizioni hanno mostrato un'elevata somiglianza, esibendo l'emissione più intensiva a 365 nm di eccitazione. Pertanto, è stata utilizzata la luce della lampada al mercurio a 365 nm in combinazione con un 400-filtro nmedge (K400). Come mostrato in Fig. 1d, l'applicabilità di questi parametri ottici è evidenziata da chiari picchi di segnale delle bande di analiti anche in presenza di matrici di campioni co-estratte.

Ottimizzazione e validazione della quantificazione

Linearità e sensibilità

La capacità quantitativa del rilevamento densitometrico stabilito è stata prima convalidata in termini di linearità e sensibilità. A tal fine è stato stabilito un grafico di calibrazione basato su 5 livelli entro le concentrazioni da 100 a 2000 pg/banda. Riassunto nella tabella 1, risultati ottenuti daHPTLC-FLD ha mostrato una buona linearità con coefficienti di correlazione soddisfacenti (R2=0.9999). Sulla base della curva di calibrazione, la sensibilità del metodo, compreso il limite di rilevabilità (LOD) e la quantificazione (LOQ) sono state calcolate secondo il metodo DIN 32645 con una confidenza statistica del 95% (Deutsches Institut für Normung 2013). Dal calcolo, il LOD espresso aspg/banda era 45 e 52 rispettivamente per FWA 184 e FWA 367. Fissando il volume dell'applicazione a 10 μL, tale rilevabilità era rispettivamente pari a 18 e 21 ug/kg, che erano circa 30-pieghe al di sotto del limite di tolleranza legislativa (600 ug/kg) stabilito dall'UE (Unione Europea 2002).

Recupero e Precisione

Prima di valutare l'accuratezza dello sviluppatoHPTLC-FLD determinando i tassi di recupero degli analiti addizionati nei campioni di cereali, dovrebbe essere ottimizzato un metodo di estrazione adeguato. Per l'estrazione di FWA nella farina di cereali, Wu et al. suggerire di utilizzare una miscela di diclorometano e acetone (3/2, v/v) (Wu et al. 2018). Per quanto riguarda la tossicità ambientale e ccarcinogena del diclorometano, le miscele di acetato di etile e acetone sono state testate in alternativa come solvente di estrazione qui. Come presentato in modo esemplificativo in Fig. 2, era ovvio che l'acetato di etile puro era la scelta migliore per estrarre il composto mirato da entrambi i campioni di cereali, paragonabili a quelli del metodo di Wu et al.(2018). Per garantirne l'applicabilità, il metodo di estrazione ottimizzato è stato esteso a 6 campioni di cereali di cui 3 di farina di frumento e 3 di farina di riso sono stati ulteriormente testati per l'esperimento di recupero della punta. Come riassunto nella Tabella 2, i tassi di recupero calcolati erano compresi tra 88,7 e 108,4 percento. Nel frattempo, la riproducibilità della quantificazione in termini di deviazione standard relativa (% RSD) dei triplicati è risultata inferiore al 10,5%. l'analisi quantitativa potrebbe essere un efficace strumento di screening perFWAin campioni di cereali, con accuratezza e precisione accettabili.

Determinazione FWA in campioni di cereali confezionati

Per valutare ulteriormente l'idoneità delle condizioni di estrazione ottimizzate eHPTLC-Rilevamento FLD, il metodo è stato applicato in modo esemplare per quantificare due campioni di cereali la cui confezione contiene FWA. Semplicemente dall'ispezione visiva sull'immagine della piastra mostrata in Fig. 3a, è stato molto facile raggiungere la conclusione che entrambi i campioni di cereali erano stati contaminati con residui di FWA. Quindi, la quantificazione è stata effettuata mediante FLDscanning. Come mostrato in Fig. 3b, nel dendrogramma ottenuto è possibile osservare una buona selettività del rilevamento. Come riassunto nella tabella 3, i residui di analiti in entrambi i prodotti a base di cereali erano entro il livello di ug/kg (massimo 262,8 ug/kg), che erano significativamente al di sotto dei loro limiti di migrazione specifica (600 ug/kg). Anche così, anche i potenziali impatti negativi di tale contaminazione sono rimasti allarmanti, poiché gli effetti negativi causati dall'esposizione cronica non erano ancora sufficienti.

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Identificazione molecolare mediante impronte digitali MS

Per ottenere l'identificazione chimica delle bande risultantiHPTLCsviluppo, il rilevamento della SM in situ è ​​stato incorporato nell'approccio di screening come strumento di conferma, facilitato da un'interfaccia TLC-MS basata sulla testa di eluizione. I composti all'interno delle bande di interesse sono stati lavati via dallo strato di gel di silice e misurati direttamente mediante elettrospray MS. La tabella 4 riassume il segnale diagnostico degli analiti registrati dallo strato di gel di silice. Era chiaro che 363,1 m/z erano il segnale ionico più abbondante per FWA 184, mentre 431,2 m/z per FWA 367. Concordando bene con gli ioni molecolari teorici nella forma protonata, questi segnali specifici erano chiaramente evidenti e quindi possono essere usati come prova dell'impronta digitale per la conferma. Inoltre, l'applicabilità di questo metodo è stata convalidata in modo esemplare con risultati positivi in ​​campioni reali. Come mostrato in Fig. 4, i segnali ottenuti hanno mostrato una buona somiglianza con l'impronta digitale dell'analita, dimostrando che le bande sospette possono essere assegnate in modo inequivocabile a composti mirati.

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Conclusioni

In questo lavoro,HPTLCè stato impiegato con successo come piattaforma flessibile che assembla in modo efficiente la separazione e l'analisi spettroscopica, per una facile quantificazione e conferma della contaminazione da FWA nei campioni di cereali. Con un metodo di estrazione ottimizzato, gli analiti nei campioni di farina di frumento e riso sono stati quantificati selettivamente e accuratamente mediante HPTLC-FLD, con buona linearità e LOD significativamente al di sotto del limite di tolleranza. Inoltre, i risultati separati che rimangono sullo strato di placcatura sono stati ulteriormente collegati all'analisi MS in situ, consentendo una rapida identificazione della molecola di bande positive in tracce separate, garantendo quindi inequivocabilmente l'affidabilità dei risultati dello screening. Di fronte alle sfide sollevate dalla realtà dell'analisi dello screening degli alimenti, l'importanza di HPTLC è stato sempre più riconosciuto. Il lavoro ha dimostrato che HPTLC, in quanto piattaforma versatile che integra il rilevamento quantitativo e qualitativo in modo estremamente efficiente in termini di costi, può essere un potente strumento nella chimica analitica degli alimenti.

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