Combinazioni di farmaci sinergici con schermo a base di silico da medicinali a base di erbe: un caso con l'uso di Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Modulo di Neuroprotezione

La neuroprotezione comprende i meccanismi e le strategie utilizzati per proteggere dalle lesioni neuronali o dalla degenerazione del sistema nervoso centrale a seguito di disturbi acuti (ad es. ictus o lesioni/traumi del sistema nervoso) o come risultato di malattie neurodegenerative croniche (ad es. Parkinson, Alzheimer, sclerosi multipla). L'obiettivo della neuroprotezione è limitare la disfunzione/morte neuronale dopo una lesione del sistema nervoso centrale e tentare di mantenere il livello più alto

possibile integrità delle interazioni cellulari nel cervello con conseguente funzione neurale indisturbata. Come si può vedere dalla Fig. 4, alcuni bersagli sulla via della sinapsi serotoninergica sono coinvolti nella funzione di neuroprotezione. Ad esempio, la produzione di prostaglandine attraverso PTGS1 e PTGS2 (note anche come COX-1 e COX-2) è un mediatore essenziale nell'evocare meccanismi antinfiammatori e nuovi pro-risoluzione56. Uno studio recente ha dimostrato che l'espressione genica di ADCY5, un enzima che catalizza la generazione di cAMP57, è ridotta dalla metilazione del promotore nelle linee cellulari di HCC umano indotte da COX-2-58. Sulla base dell'analisi di cui sopra, ipotizziamo che l'accumulo di COX-2 possa influenzare la secrezione di sAPP, la scissione di APP scissa dalla -secretasi che è modulata dal cAMP ed esercita ulteriormente l'effetto neuroprotettivo59,60. I nostri risultati mostrano che la neuroprotezione gioca un ruolo importante nel trattamento della neuroinfiammazione.

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Validazione sperimentale

La vitalità delle cellule microgliali BV2 trattate dai composti

Le cellule microgliali BV2 (8×104 cellule/ml) vengono alimentate con concentrazioni da 37,5 a 300 μM per millilitro di terreno di coltura senza siero dei quattro composti per 24 ore. Consideriamo la vitalità cellulare del gruppo di controllo coltivato in assenza di siero con meno dello 0,1% di DMSO come del 100% (Fig. 5 (a-d)). Non si osserva alcuna citotossicità cellulare significativa ai dosaggi prescritti dai gruppi.

Convalida della sinergia farmacologica e del potenziale effetto antinfiammatorio in vitro

Per valutare ulteriormente i risultati ottenuti in silico, sono stati selezionati quattro composti che coprono tre coppie sinergiche, vale a dire isoacteoside, 2′-acetilatteoside, echinacoside e verbascoside, per esaminare i loro effetti sinergici farmacologici e il potenziale effetto antinfiammatorio utilizzando cellule BV2 trattate con LPS. In particolare, conduciamo analisi Western Blot per l'espressione delle proteine ​​iNOS e COX-2 per confermare la sinergia e gli effetti antinfiammatori delle combinazioni di farmaci previste.

Come mostrato in Fig. 5 (e-g), vengono riportati i livelli delle proteine ​​iNOS e COX-2 nel pannello di linee cellulari BV2 testate. Osserviamo che nel trattamento con isoacteoside o 2′-acetilatteoside, le espressioni proteiche di iNOS e COX-2 nelle cellule BV2 diminuiscono entrambe in modo significativo a diversi livelli di dose. Tuttavia, il trattamento con la combinazione di isoacteoside e 2′-acetilacteoside induce un aumento significativo dei fattori infiammatori iNOS e COX-2 (Fig. 5 (e)). La Figura 5(f) lo illustratrattamento con echinacoside o verbascoside, come agente singolo, provoca una diminuzione dell'espressione iNOS e COX-2. Inoltre, come previsto, il trattamento con echinacoside in combinazione con verbascoside alla concentrazione di 150 μM ha comportato una diminuzione più pronunciata della

livelli di espressione proteica (iNOS e COX-2), indicando gli effetti antinfiammatori sinergici di questa combinazione di farmaci. Allo stesso modo, come indicato nella Figura 5 (g), la combinazione di echinacoside e 2'-acetilatteoside mostra un significativo effetto sinergico sull'inibizione di COX-2 alla concentrazione di 75 μM o 300 μM. Tuttavia, per iNOS, al dosaggio di 300 μM, la combinazione rappresenta una marcata soppressione della proteina. Al contrario, troviamo che non ci sono evidenti effetti di inibizione sia su iNOS che su COX-2 riguardo alla combinazione di isoacteoside e 2′-acetilacteoside o echinacoside e verbascoside alla concentrazione di 75μM (Figura 2 supplementare), inoltre, il trattamento con altre coppie mostra un effetto molto più debole rispetto ai singoli agenti al dosaggio di 150 o 300μM che può essere visto in Fig. 5 (e-g).

Per riassumere, lo studio in vitro fornisce ulteriori informazioni per lo screening di combinazioni di farmaci con effetti potenzialmente antinfiammatori e dimostra l’affidabilità della strategia di screening in silico.

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Discussione

La neuroinfiammazione è implicata nella maggior parte delle malattie neurologiche, psichiatriche e dello sviluppo neurologico e non è solo una conseguenza ma potrebbe essere un fattore scatenante della patologia. Tuttavia, gli attuali trattamenti per le malattie neuroinfiammatorie sono per lo più monoterapie, limitate da effetti collaterali ben noti, come sappiamo, gli inibitori della COX-2 possono portare a difetti cardiovascolari in risposta al trattamento a lungo termine e il trattamento mirato al TNF potrebbe causare infezioni attraverso immunosoppressione. Gli approcci terapeutici combinatori possono essere indispensabili per migliorare il trattamento di malattie complesse con i seguenti vantaggi: robustezza della rete contrastata e compensazione del bypass, maggiore efficacia clinica pur mantenendo una tossicità umana minima e dosaggio ridotto di ciascun composto63. Tuttavia, l’esplorazione delle combinazioni farmacologiche sinergiche tra composti derivati ​​da medicinali a base di erbe basate sulla farmacologia di sistema è limitata dalla possibile ragione principale per grandi quantità di composti.

Nel lavoro, otteniamo innanzitutto 63 potenziali composti bioattivi dalerba Cistanche tubulosa, soddisfacendo i criteri (DL Maggiore o uguale a 0.18) per ulteriori analisi con l'aiuto della previsione che è indispensabile per escludere molecole più promettenti con proprietà desiderabili. Dopo aver mappato i 133 target dei 63 potenziali composti bioattivi nel database, otteniamo 43 target correlati alla neuroinfiammazione e quindi l'analisi di clustering GOBP dei target previsti può probabilmente contribuire al trattamento della neuroinfiammazione. Il risultato analitico della rete CT ha mostrato un grado medio per composto di 11,209 e 7,651 per target, rispettivamente, e 38 di essi hanno corretto più di 7 target (maggiori del grado medio). Ad esempio, l’echinacoside (mol41) previsto con 7 target, il verbascoside (mol33), con 9 target, o il tableside B (mol57), con 8 target potrebbero svolgere un ruolo chiave nella neuroprotezione in linea con la crescente letteratura.

Raggiungiamo obiettivi terapeutici diretti come APP, MAPT (noto anche come Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 e HTR2A (noto anche come 5-HT2A), GRIN2B (recettore ionotropico del glutammato tipo subunità 2B di NMDA) e GRIA1 (subunità 1 del recettore ionotropico del glutammato tipo AMPA) o potenziali bersagli a valle come PTGS274 o NOS275 associati a neuroinfiammazione o varie malattie del sistema nervoso.

L'analisi della rete Compound-Target-Pathway mostra 12 composti dalle 10 principali coppie di farmaci attraverso l'algoritmo PEA, collegati ai 43 potenziali bersagli e ai percorsi collegati alla neuroinfiammazione, ad esempio la via di segnalazione del calcio, l'interazione ligando-recettore neuroattivo o Via di segnalazione del TNF e così via. Nel sistema, questi composti previsti potrebbero agire non solo sulle proteine ​​a monte ma anche sui percorsi a valle associati alla neuroinfiammazione e ai biomarcatori infiammatori, in particolare. Inoltre, vengono fornite ulteriori informazioni per lo screening di combinazioni di farmaci con effetti potenzialmente antinfiammatori e l'affidabilità della strategia di screening in silico viene verificata mediante validazione sperimentale. La via della neuroinfiammazione comprende la via della malattia di Alzheimer, la via di segnalazione del calcio, la via di segnalazione del GnRH, la via di segnalazione del VEGF e la sinapsi serotoninergica. I risultati analitici ci hanno spiegato chiaramente che i moduli di morte cellulare, infiammazione e neuroprotezione sono esemplificati per decifrare il meccanismo diCistanche tubulosa per il trattamento della neuroinfiammazione.

La neuroinfiammazione accompagna varie malattie neurodegenerative che potrebbero essere non solo una conseguenza ma un fattore scatenante della patologia, pertanto si suggerisce che le terapie antinfiammatorie siano un approccio terapeutico promettente. Con nostro disappunto, sebbene ci siamo resi conto dei limiti delle monoterapie, la valutazione e i meccanismi sottostanti delle terapie combinate rappresentano ancora le principali sfide nello sviluppo della nuova strategia alternativa. Questo lavoro potrebbe quindi offrire nuove opportunità terapeutiche per la neuroinfiammazione e potrebbe aprire una nuova strada per scoprire combinazioni di farmaci da prodotti naturali.

Materiali e metodi

Raccolta dei composti

Un totale di 66 ingredienti chimici di Cistanche tubulosa sono raccolti manualmente da TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, inclusi 26 glicosidi feniletanoidi, 22 iridoidi, 4 lignani, 7 glicosidi monoterpenici, 2 sostanze azotate, 3 benzene acriloil zuccheri, 1 sterolo, 1 chetolo. Dato cheglicosidi presenti nella Cistanche tubulosavengono solitamente idrolizzati per liberare aglicone che viene poi assorbito nella mucosa intestinale, prendiamo quindi in considerazione le molecole senza glicolico, che sono etichettate come _qt. Ciò ha portato alla generazione dei 103 composti. Queste molecole sono fornite nella Tabella Supplementare S1.

Valutazione della similarità dei farmaci

Per ottenere i potenziali composti bioattivi dalla Cistanche tubulosa, valutiamo la somiglianza farmacologica di questi ingredienti calcolando la somiglianza Tanimoto tra i composti vegetali e le proprietà molecolari medie di tutte le sostanze chimiche nel database Drugbank. Inoltre, il modello di previsione DL è stato applicato con successo in molti studi per selezionare composti bioattivi. Nel lavoro, l'indice DL Maggiore o uguale a 0.18 dei candidati è definito come valore soglia per meglio adattarsi alle analisi successive.

Previsione del bersaglio del farmaco

L’identificazione degli obiettivi di efficacia per i composti leader rimane un passo fondamentale per far avanzare i composti nello sviluppo di farmaci. Qui, due strumenti interni: SysDT e WES vengono utilizzati per ricavare le informazioni sui target molecolari per la pesca dei farmaci. SysDT è un modello in-solo che viene eseguito con la combinazione di informazioni chimiche, genomiche e farmacologiche basate su due potenti strumenti matematici: Random Forest (RF) e Support Vector Machine (SVM) per affrontare in modo efficace il problema dell'identificazione del target. Il modello ottenuto è servito come una preziosa piattaforma per la previsione delle interazioni farmaco-bersaglio con un'accuratezza complessiva del 97,3%, un'accuratezza della previsione attivata dell'87,7% e un'accuratezza della previsione inibita del 99,8%. Per acquisire componenti più promettenti, i criteri di filtraggio sono definiti come valore RF maggiore o uguale a 0.7 o SVM maggiore o uguale a 0.8 in questo studio.

La similarità d'insieme ponderata (WES) è un nuovo potente modello computazionale per individuare gli obiettivi diretti del farmaco rispetto agli ingredienti bioattivi effettivi. Essendo uno strumento innovativo, il modello ottenuto si comporta bene nel prevedere il legame con una sensibilità media dell'85% (SEN) e i modelli non vincolanti con il 71% (SPE) con le aree medie sotto le curve operative del ricevitore (ROC, AUC) dell’85,2% e una concordanza media del 77,5%. I target ottenuti vengono ulteriormente mappati su Uniprot per normalizzare successivamente i loro nomi e organismi. Qui scegliamo solo gli obiettivi dell’Homo sapiens per ulteriori analisi. I bersagli candidati dei composti selezionati vengono mappati nel database CTD per ottenere le malattie correlate e infine escludiamo potenziali bersagli correlati alla neuroinfiammazione.

GO Arricchimento e analisi per obiettivi

Per sondare i processi biologici coinvolti dei target ottenuti, mappiamo i target su DAVID e in questa sezione vengono scelti i termini con valore P inferiore a 0.05.

Analisi della combinazione di farmaci

Nel nostro lavoro precedente, un quadro di farmacologia di sistema è stato sfruttato per prevedere le combinazioni di farmaci su un modello di nuova concezione, denominato Probability Ensemble Approach (PEA) per analizzare l’efficacia clinica e gli effetti avversi delle combinazioni di farmaci. Nel dettaglio, è stata sviluppata una rete bayesiana che si integra con un algoritmo di similarità per modellare le combinazioni degli effetti molecolari e farmacologici dei composti. Successivamente è stata presentata la valutazione combinata che copriva l'efficacia clinica e gli effetti avversi per le coppie previste. In breve, mostra che la PEA potrebbe prevedere l'efficacia delle coppie con elevata specificità e sensibilità (AUC=0.90) nel nostro lavoro. In questo lavoro, selezioniamo le prime dieci combinazioni di farmaci in base alle loro probabilità di sinergia, che rappresentano la possibilità di indurre sinergia tra due composti.

Costruzione e analisi di reti/percorsi

Per studiare le relazioni tra i principi attivi e le malattie infiammatorie, la rete composto-bersaglio (CT) e la rete composto-bersaglio-percorso (CTP) sono generate da Cytoscape 2.8.1, un popolare pacchetto bioinformatico per la visualizzazione della rete biologica e l'integrazione dei dati. Le proprietà quantitative della rete vengono analizzate dai due plugin seguenti Network Analyser e CentiScaPe 1.2. Nella rete grafica, i nodi indicano composti, bersagli o percorsi mentre i bordi codificano l'interazione farmaco-bersaglio. Per esplorare ulteriormente gli effetti biologici del funzionamento degli obiettivi cellulari attraverso la modulazione di molteplici percorsi metabolici, un "percorso" incorporato viene assemblato dalle informazioni aggiornate sulla patologia neuroinfiammatoria. In primo luogo, mappandoli sul database KEGG, i profili target raggiunti vengono aggregati in diversi percorsi. Abbandonate le sezioni indirette, poi, si integra manualmente un percorso relativamente sintetizzato sulla base dei dati patologici e clinici.

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Validazione sperimentale

Preparazione dei campioni

Echinacoside, verbascoside, isoacteoside e 2'-acetilatteosidevengono acquistati da Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Cina). I campioni di prova vengono sciolti in dimetilsolfossido (DMSO) (Sigma, USA) per ottenere 100 mM, come soluzione madre, e quindi conservati a 4 gradi. Le diluizioni finali di DMSO aggiunte al terreno di coltura non hanno mai superato lo 0,1%, garantendo così l'assenza di effetti sulla vitalità cellulare.

Coltura cellulare

Le cellule microgliali di topo BV2 sono state originariamente sviluppate dalla banca cellulare dell'Accademia cinese delle scienze di Shanghai e coltivate in compiti di 25 o 75 cm2 con il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, USA) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) (Gibco BRL, USA), penicillina G (100 unità/ml) e streptomicina (100 mg/ml) in un'incubatrice umidificata con 5% CO2/95% O2 a 37 gradi.

Saggio di vitalità cellulare

Le cellule microgliali BV2 vengono seminate in una piastra a pozzetti 96- ad una densità di 1×105 cellule/ml, dopo aver incubate per 18 ore, le cellule vengono trattate con 100 ul di terreno fresco con o senza le varie concentrazioni indicate di campioni di prova per altre 24 ore Il test CCK-8 (BestBio, Shanghai, Cina) è un metodo conveniente e affidabile per determinare la vitalità delle cellule. Per eliminare il fondo dei campioni di prova, scartiamo l'intero terreno di coltura, dopodiché vengono aggiunti 100 ul/pozzetto di terreno fresco contenente una soluzione di CCK-8 al 10%. I valori di OD a 450 nm vengono letti su un lettore di micropiastre (Molecular Devices, California, USA) dopo un'incubazione di 3 ore a 37 gradi e 5% di CO2.

Analisi Western Blot

La proteina cellulare viene estratta dalle linee cellulari utilizzando un kit Qproteome™ Mammalian Protein Prep (Qiagen, Germania) dopo le procedure indicate dal protocollo del produttore. Il kit Quick Stari Bradford Protein Assay (Bio-Rad, USA) viene applicato alla quantificazione delle proteine. Quantità equivalenti di proteine ​​(50ug) vengono denaturate mediante ebollizione a 100 gradi per 10 minuti con tampone di caricamento del campione 2*laemmli (Bio-Rad, USA) più mercaptoetanolo al 5% in un rapporto di 1:1 e caricato per corsia su SDS-PAGE al 12% (minigel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato), elettrotrasferito su membrane fuoride di polivinilidene da 0,45 μm (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, USA) per 150 minuti a 200 mA. Successivamente, le membrane vengono bloccate in albumina di siero bovino (BSA) al 3% a temperatura ambiente e incubate con gli anticorpi primari iNOS e COX-2 (Abcam) a 4 gradi durante la notte. Dopo tre lavaggi approfonditi in soluzione salina-Tween tamponata con Tris (TBST) ciascuno per 5 minuti, le membrane vengono sondate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (diluizioni 1:10000; Abcam) per 1,5 ore a temperatura ambiente. Le bande immunoreattive vengono quindi visualizzate utilizzando un kit di rilevamento della chemiluminescenza ECL (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA) dopo aver lavato due volte in TBST e una volta in TBS, ogni volta per 5 minuti. I valori densitometrici vengono normalizzati utilizzando -actina come controllo interno di caricamento.

Analisi statistica

I dati vengono presentati come media ± errore standard e l'analisi Western blot viene ripetuta in tre esperimenti indipendenti con lo stesso risultato. L'analisi della varianza unidirezionale viene utilizzata per confrontare le differenze delle medie per tre o più gruppi, la significatività statistica viene analizzata con il test t di Student tra due gruppi.

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