L'infezione naturale del parvovirus nei gatti selvatici della pesca (Prionailurus Viverrinus) rivela la localizzazione virale esistente nei reni

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Astratto

Il protoparvovirus carnivoro-1 (CPPV-1), una specie virale contenente varianti del virus della panleucopenia felina (FPV) e del parvovirus canino (CPV), è ampiamente diffuso tra i carnivori domestici e selvatici causando malattie sistemiche fatali. Il gatto pescatore selvatico (Prionailurus viverrinus), una specie globalmente vulnerabile, è stato trovato morto. L'esame post mortem delle carcasse ha rivelato lesioni nell'intestino, nella milza eRenale. L'identificazione dell'antigene CPPV-1 in questi tessuti, mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR) e l'immunoistochimica (IHC), ha supportato l'infezione da parte del virus. Positività PCR e IHC in tessuti renalihanno rivelato una localizzazione atipica del virus mentre l'ibridazione in situ (ISH) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) con la tecnica pop-off hanno confermato la prima descrizione della localizzazione virale inreni. La caratterizzazione completa del genoma e l'analisi degli aminoacidi dedotti del CPPV-1 ottenuto dai gatti da pesca hanno rivelato che l'FPV è un agente eziologico. Le sequenze FPV rilevate hanno mostrato mutazioni di amminoacidi a I566M e M569R nella proteina del capside. Le analisi filogenetiche ed evolutive delle sequenze codificanti complete del genoma hanno rivelato che i genomi del gatto pescatore CPPV-1 sono raggruppati geneticamente nei genomi FPV isolati dai gatti domestici in Thailandia. Dagli anni '70, è stato anche dimostrato che questi genomi condividono un'evoluzione genetica con i ceppi cinesi di FPV. Questo studio è la prima prova di infezione da CPPV-1 nei gatti da pesca ed è il primo a mostrarne la localizzazione nelreni. Questi risultati supportano la gamma multi-ospite di questo parvovirus e suggeriscono che infezioni fatali da CPPV-1 potrebbero causare altri carnivori selvatici vulnerabili.

Parole chiave: tessuto renale; malattie renali, renali, renali, tubulari renali

introduzione

Il genere Prionailurus, famiglia Felidae, è classificato come un gruppo di gatti selvatici maculati, di piccole dimensioni, originari dell'Asia [1]. Il genere Prionailurus comprende quattro specie di felini selvatici formalmente riconosciute tra cui il gatto leopardo (P. bengalensis), il gatto a testa piatta (P. planiceps), il gatto maculato ruggine (P. rubiginosus) e il gatto pescatore (P. viverrinus). [2]. Il gatto pescatore vive principalmente in prossimità di paludi e mangrovie. Vive esclusivamente nel sud e nel sud-est asiatico ed è più diffuso in Thailandia [3, 4]. Al momento, le popolazioni di gatti pescatori sono minacciate poiché le zone umide in cui vivono sono state distrutte nell'ultimo decennio. Di conseguenza, questa specie è attualmente considerata vulnerabile ed è nella Lista Rossa dell'Unione Internazionale per la Conservazione della Natura (IUNC) [3]. A causa della perdita del loro habitat, le colonie di gatti da pesca sono migrate e occasionalmente vivono in aree dove vivono animali domestici e umani [5]. Questo fenomeno di ambiente condiviso può portare a un aumento della diffusione di agenti patogeni tra animali selvatici e domestici suscettibili e viceversa. Negli ultimi decenni sono state documentate segnalazioni di focolai mortali in animali selvatici o domestici che potrebbero essere derivati ​​da uno spillover di agenti patogeni [6-9]. Pertanto, la dinamica di trasmissione dei patogeni da quegli animali dovrebbe essere esaminata e necessita di ulteriori indagini.

La cistanche migliorerà la funzionalità renale/renale

Il protoparvovirus carnivoro-1 (CPPV-1), una specie virale che comprende il virus dell'enterite del visone (MEV), il parvovirus del procione (RPV), il virus della panleucopenia felina (FPV) e varianti del parvovirus canino (CPV), è stato riconosciuto come un importante patogeno associato a malattie mortali nelle famiglie dei Canidi e dei Felidi sia selvatici che domestici [10, 11]. È stato ipotizzato che FPV, un patogeno comune delle specie Felidae, sia un antenato comune di CPV [12-14]. Il CPV infetta frequentemente gli animali della famiglia Canidae e vi è una crescente evidenza di infezione nella controparte della famiglia Felidae [9, 15, 16]. In precedenza, si ipotizzava che FPV e CPV fossero un virus limitato dall'ospite. Tuttavia, diversi risultati hanno successivamente indicato che alcuni animali della famiglia Canidae potrebbero svolgere un ruolo come serbatoio per FPV o viceversa [11, 17, 18]. Inoltre, diversi rapporti hanno indicato che le varianti FPV e CPV (CPV-2a, -2b e -2c) condividono host suscettibili. Questi ospiti non sono solo animali domestici ma anche una varietà di specie carnivore [15, 19, 20], suggerendo un intervallo multi-ospite di CPPV-1 [11].

Dal 1996 al 1997, le varianti di CPV sono state rilevate per la prima volta nei gatti leopardo e inizialmente sono state designate come parvovirus del gatto leopardo (LCPV), suggerendo la prima descrizione di CPPV-1 nel genere Prionailurus [21, 22]. Alcuni di questi ceppi di LCPV si sono rivelati geneticamente divergenti dal CPV-2a e -2b precedentemente descritto a causa di una mutazione dell'amminoacido G300A nella proteina del capside (VP). Ciò ha comportato un cambiamento nelle sue proprietà antigeniche che ora vengono utilizzate come punto di mutazione unico per differenziare CPV-2c da altre varianti di CPV [22]. La scoperta della nuova variante CPV (attualmente nota come CPV-2c) nei gatti leopardo ha supportato l'idea di una coevoluzione del CPPV-1 tra le specie animali. Successivamente, sono state segnalate infezioni delle varianti FPV e CPV nei gatti leopardo [9]. Ciò ha suggerito che altre specie dello stesso genere del gatto leopardo (genere Prionailurus) potrebbero essere suscettibili all'infezione da CPPV-1. Finora, la suscettibilità all'infezione da CPPV-1 in altre specie del genere Prionailurus è ancora in gran parte sconosciuta. Decifrare come si stanno evolvendo le varianti CPPV-1 e come si comportano le nuove varianti emergenti può aiutare a chiarire come prevenire un possibile focolaio della nuova variante. Anche se il nuovo virus raggiunge gamme di ospiti più ampie, in un nuovo ospite suscettibile potrebbero essere osservati focolai fatali o lesioni atipiche associate all'infezione. Questo studio descrive un'infezione fatale da CPPV-1 nei gatti pescatori selvatici (Prionailurus viverrinus). La caratterizzazione genetica del CPPV ottenuto-1 rivela FPV come agente causale. Questa scoperta fornisce la prima prova dell'infezione da FPV in questa specie e svela il trofismo cellulare unico di questo virus. Un'ulteriore delucidazione dell'infezione da FPV e delle sue varianti in questa specie è necessaria per la sua spiegazione dell'infezione globale in numerose specie vulnerabili.

Materiali e metodi

Animali ed esame autoptico di routineNel giugno 2019, due gatti pescatori selvatici (P. viverrinus), hanno designato il caso n. 1 e 2 sono stati trovati morti nell'area suburbana della provincia di Nakhon Ratchasima, in Thailandia. Più tardi, nell'agosto 2019, un altro gatto da pesca, designato caso n. 3, è stato soccorso nell'area in cui sono stati trovati i primi due gatti pescatori. A causa della gravità della disidratazione, il caso n. 3 sono morti durante il rinvio all'ospedale per animali. Questi tre gatti da pesca sono stati sottoposti a un'indagine post mortem come processo di routine. Sfortunatamente, non erano disponibili campioni di animali domestici in libertà o specie selvatiche ospitati nella stessa area; quindi, non sono stati inclusi in questo studio. L'esame autoptico di routine è stato eseguito su tutti i gatti da pesca. Organi vitali selettivi tra cui polmone, fegato, cuore, milza erenesono stati campionati da tutti i gatti da pesca, mentre l'intestino e il linfonodo mesenterico sono stati inoltre raccolti dal gatto da pesca n.3. Tutti i tessuti selezionati sono stati sottoposti all'esame istologico e campionati individualmente per ulteriori saggi molecolari. Per l'istologia, i tessuti sono stati immersi in formalina tamponata neutra al 10 percento (v/v) per almeno 24 ore e processati di routine. Quindi sono stati colorati con ematossilina ed eosina

(H&E) utilizzando procedure standard prima dell'indagine da parte di un patologo veterinario (TK) certificato dal consiglio dell'ACVP. I campioni di tessuto fresco ottenuti dai tre gatti pescatori sono stati conservati a –80˚C per studi molecolari. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti in seguito all'approvazione del Chulalongkorn University Animal Care and Use Committee (n. 1931036).

Saggi molecolari virologici generaliI campioni di tessuto fresco inclusi cuore, polmone, fegato, milza erenedi tutti i gatti da pesca più tessuti linfonodali intestinali e mesenterici aggiuntivi del gatto da pesca n. 3, sono stati sottoposti ad estrazione di acido nucleico virale omogeneizzandoli individualmente con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) all'1% (v/v). Successivamente, l'acido nucleico virale totale è stato estratto utilizzando un kit commerciale di estrazione dell'acido nucleico virale II (Geneaid, Taipei, Taiwan) seguendo il suggerimento del produttore. Gli acidi nucleici estratti sono stati quindi qualificati e quantificati in base al loro rapporto di assorbanza A260/A280 utilizzando il metodo della spettrofotometria (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA). Tutti gli acidi nucleici estratti sono stati ulteriormente sottoposti a indagine molecolare virale utilizzando l'analisi della reazione a catena della polimerasi (PCR) con diversi pannelli di test PCR della famiglia panvirologica, inclusa la rilevazione dell'herpesvirus [23], paramyxovirus [24], pneumovirus [25], calicivirus [26], virus dell'influenza [27], bocavirus [26, 28], parvovirus [29] e corona virus [30, 31]. I protocolli PCR, i reagenti, le condizioni di ciclo e i controlli positivi/negativi utilizzati nelle reazioni sono descritti nel file S1. Il rilevamento tramite PCR specifico del gene della gliceraldeide{18}}fosfato deidrogenasi (GAPDH) del felino è stato utilizzato come controllo interno come descritto in precedenza [32]. Successivamente, gli ampliconi PCR positivi sono stati visualizzati utilizzando una piattaforma di elettroforesi capillare QIAxcel (Qiagen, Hilden, Germania) come precedentemente descritto [33]. Gli ampliconi positivi di ciascun test PCR sono stati purificati e sottoposti a sequenziamento bidirezionale di Sanger (Macrogen Inc, Seoul, Corea del Sud). A causa della moderata autolisi dei tessuti, non è stato possibile effettuare indagini batteriologiche su questi gatti da pesca.

Rilevamento in situ CPPV-1 mediante immunoistochimica (IHC), ibridazione in situ (ISH) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

Lo screening molecolare virologico iniziale ha rivelato ampliconi positivi della PCR pan-parvovirus e i risultati del sequenziamento hanno anche mostrato potenziali sequenze di DNA di CPPV-1. Questi risultati ci hanno spinto a confermare ulteriormente la presenza di CPPV-1 e a localizzare la distribuzione di CPPV-1 nei tessuti dei gatti pescatori. Tessuti fissati in formalina inclusi in paraffina (FFPE) inclusi polmone, fegato, cuore, milza,renee l'intestino sono stati sottoposti al rilevamento di CPPV-1 IHC utilizzando un anticorpo monoclonale di topo anti-canino parvovirus (ab59832, Abcam, Cambridge, Regno Unito) con il sistema di rilevamento della perossidasi di rafano (HRP) (polimero EnVision, Dako, Glostrup, Danimarca) . In breve, le sezioni in FFPE sono state tagliate a uno spessore di 4-μm e ulteriormente deparaffinate e reidratate. I vetrini sono stati quindi pretrattati, la perossidasi endogena bloccata e processata come precedentemente descritto [11]. Sezioni del tessuto intestinale di un gatto con infezione da FPV e un cane con infezione da CPV sono state utilizzate come controlli positivi, mentre sezioni identiche sono state incubate con IgG purificate di capra-topo e coniglio (reagente di controllo negativo universale IHC, codice ADI-950-231-0025, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), sono stati usati come controlli negativi. Per quanto riguarda larenalenecrosi tubulare presente nelle aree in cui sono stati osservati segnali positivi per CPPV-1 IHC, ilrenesezioni di tutti i gatti da pesca sono state sottoposte a colorazione speciale Periodic AcidSchiff (PAS), al fine di dimostrare l'architettura cellulare direnetessuti.

CISTANCHE MIGLIORA LA MALATTIA RENALE/RENALE

Inoltre, la FFPErenesezioni di gatto da pesca nn. 1 e 3 sono stati sottoposti ad analisi ISH e TEM per supportare il risultato della colorazione positiva per CPPV-1 IHC e per dimostrare ultrastrutturalmente le particelle virali intessuti renali, rispettivamente. Per l'ISH, la sonda del DNA CPPV-1 che copre 393 bp [34] del gene del capside di CPPV-1 è stata costruita utilizzando un kit di sintesi della sonda PCR DIG (Roche Diagnostics, Basilea, Svizzera), secondo i suggerimenti del produttore. La reazione e la condizione del ciclo termico sono state eseguite come descritto in precedenza [34] con l'eccezione utilizzando gli oligonucleotidi marcati con digossigenina (DIG). La sonda di ibridazione costruita è stata visualizzata e confermata dalla risoluzione dimensionale sull'elettroforesi su gel di agarosio all'1,5 percento (p/v). L'ISH con DNA cromogenico è stato eseguito come descritto in precedenza [26] con lievi modifiche. In breve, dopo la deparaffinazione, la reidratazione e il successivo risciacquo in PBS, i vetrini FFPE spessi 4- μm sono stati sottoposti a digestione proteolitica, post-fissazione e pre-ibridazione. I vetrini sono stati quindi ibridati con la sonda ISH da 25 ng/μL a 42˚C durante la notte. I segnali di ibridazione sono stati visualizzati accoppiandosi con 100 μL di frammenti Fab anti-DIG-AP (Roche, Basilea, Svizzera) (1:200 in soluzione 1X Blocking) in combinazione con Liquid Permanent Red (LPR) (Dako, Glostrup, Danimarca) . I vetrini sono stati quindi colorati di contrasto con ematossilina. Si pensava che i precipitati rossi nella correlazione della morfologia cellulare fossero positivi per ISH. Per i controlli negativi, sono state utilizzate le sonde del virus del lago tilapia (TiLV) [35], invece della sonda CPPV-1. I campioni TEM sono stati preparati secondo tecniche pop-off con modifiche [36–38] e sono stati colorati con metalli pesanti come descritto in precedenza [39, 40]. L'ultrastruttura è stata studiata utilizzando TEM (HT7800; Hitachi, Tokyo, Giappone) operato a 80 kV

Caratterizzazione genetica integrale del gatto pescatore CPPV-1Poiché i risultati della PCR virologica e dello screening IHC erano in accordo e i risultati delle sequenze genomiche VP{0}} parziali ottenute dalla PCR pan-parvovirale hanno suggerito una somiglianza genetica tra i casi n. 1 e 2, ma non per il caso n. 3, abbiamo ulteriormente caratterizzato la sequenza CPPV-1 a lunghezza intera di questi gatti da pesca (casi n. 1 e 3) e classificato l'origine CPPV-1 utilizzando un insieme di coppie di primer degenerate specifiche per FPV e CPV recuperate da una precedente pubblicazione [26]. In breve, gli acidi nucleici estratti ottenuti dalla milza erenidi due gatti da pesca più tessuto intestinale aggiuntivo del gatto da pesca n. 3, sono stati amplificati individualmente utilizzando un GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) e primer specifici (file S1). Le condizioni della PCR sono state descritte in precedenza [26]. Gli ampliconi target sono stati visualizzati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio al 2% (p/v) e ulteriormente purificati utilizzando un kit di estrazione di gel di DNA Monarch (New England Biolab, Francoforte, Germania) prima del sequenziamento commerciale di Sanger. Le sequenze genomiche complete degli isolati CPPV-1 ottenuti dai due gatti da pesca sono state depositate in GenBank (numeri di accesso MW145540-MW145541).

Analisi filogenetiche, di ricombinazione ed evolutive del gatto da pesca CPPV-1 Le sequenze genomiche a lunghezza intera dei ceppi di gatto da pesca CPPV-1 sono state allineate con le sequenze complete pubblicate di CPPV-1 ottenute da varie specie ospiti , disponibile in GenBank utilizzando MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) e il software MEGA7 (http://www.megasoftware.net). Gli allineamenti di sequenza sono stati quindi sottoposti alla costruzione filogenetica dell'albero. L'albero filogenetico è stato creato utilizzando il metodo della massima verosimiglianza (ML) con il modello Hasegawa–Kishino–Yano con distribuzione gamma (HKY più G), che è stato selezionato utilizzando l'algoritmo del modello find-best-fit in MEGA7 secondo il criterio di informazione bayesiano . L'albero è stato avviato con 1,{10}} repliche. La somiglianza di sequenza a coppie tra i genomi CPPV-1 è stata calcolata utilizzando il modello di massima verosimiglianza composita e la loro distanza evolutiva è stata analizzata in MEGA7. Le identità nucleotidiche a coppie di output sono state generate e visualizzate in formato Microsoft Excel (file S2). La sequenza di allineamento dell'output di CPPV-1 è stata quindi utilizzata come modello per l'analisi della ricombinazione genetica utilizzando due pacchetti software statisticamente indipendenti. In breve, l'allineamento ha identificato i potenziali ceppi di ricombinazione utilizzando il software integrato Recombination Detection Program 4 (RDP4) Package V. Beta 4.94 e questo è stato sottoposto a controlli incrociati con un diagramma di somiglianza e un'analisi bootscanning nel pacchetto software SimPlot V. 3.5.1. Le impostazioni dei programmi e l'interpretazione dei risultati sono state condotte come descritto in precedenza [26, 41].

FPer l'analisi evolutiva del gatto pescatore CPPV{{0}}, è stato recuperato un set di dati di 224 sequenze genomiche complete contenenti 26 sequenze FPV-, 6 MEV- e 192 CPV, tutte originarie di 18 paesi tra il 1979 e il 2019 dal database GenBank. L'analisi evolutiva è stata eseguita con le 2 potenziali sequenze CPPV-1 ottenute da gatti pescatori utilizzando il modello bayesiano Markov chain Monte Carlo (BMCMC) implementato in BEAST V. 2.4.8 [42]. Il jModelTest [43] è stato eseguito per identificare il modello di sostituzione nucleotidica più adatto per sequenze di allineamento multiple. I modelli di sostituzione più adatti sotto modelli di orologio lognormali rilassati e rigidi a dimensioni di popolazione costanti poiché i precedenti sono stati implementati per tenere conto dei vari tassi evolutivi tra i lignaggi. Le frequenze di base precedenti e empiriche dell'albero dello skyline bayesiano coalescente sono state ottenute in base al modello di orologio più adatto e sono state eseguite per 100 milioni di catene, campionando ogni 10000a generazione, con il primo 10% scartato come burn-in. La convergenza dei parametri è stata confermata calcolando la dimensione effettiva del campione utilizzando il programma TRACER V. 1.7.0 [44]. Gli alberi di credibilità massima del clade sono stati annotati utilizzando TreeAnnotator V. 1.8.3 [42]. L'albero filogenetico con divergenza stimata, sequenza temporale variabile, probabilità a posteriori e densità posteriore più alta del 95% (HPD) è stato generato e visualizzato utilizzando FigTree V. 1.4.3 [45].

Studio retrospettivo dell'antigene CPPV-1 nei carnivori della fauna selvaticaAl fine di esplorare il ruolo del CPPV-1 associato alla morbilità e mortalità con cause sconosciute nei carnivori selvatici nel lontano e recente passato, sono stati inclusi 305 campioni freschi selettivi per l'estrazione genomica e il targeting dell'identificazione del CPPV{{2} } gene del capside come descritto sopra. Questi campioni sono stati ottenuti dal 2013 come tamponi fecali o contenuto intestinale. Sono stati ottenuti da 136 animali dello zoo di 27 diverse specie carnivore (Tabella S1). Risultati Risultati post mortem e localizzazione tissutale del gatto da pesca CPPV-1 Tutti i gatti da pesca sottoposti a necroscopia erano moderatamente emaciati con vari gradi di disidratazione, mentre 2 dei 3 gatti da pesca (casi n. 1 e 2) hanno mostrato un'autolisi moderata. In primo piano, la milza erenierano congestionati in tutti i gatti da pesca. Il gatto pescatore n.3 presentava lesioni macroscopiche di enterite catarrale che contenevano un contenuto acquoso marrone-giallastro nei loro lumi e congestione del linfonodo mesenterico. Istologicamente, il polmone del gatto da pesca n. 3 ha rivelato una grave congestione con infiltrazione di cellule mononucleate negli alveoli. Il fegato mostrava una lieve epatite periportale, caratterizzata da infiltrazione di cellule mononucleate nelle triadi portale epatiche. Gradi simili di congestione splenica con pochi follicoli linfoidi splenici sono stati osservati in tutti i gatti da pesca. I follicoli linfoidi erano esauriti ei follicoli linfoidi rimanenti in mezzo all'architettura splenica collassata con un numero maggiore di trabecole spleniche prominenti (Fig. 1A). C'erano detriti cariorretici sparsi di linfociti con

Fig 1. Infezione da CPPV-1 nei gatti da pesca. Immagini dimostrative H&E (A, C) e CPPV-1 IHC (B, D) di gatti pescatori. (A) Gatto da pesca n. 1. Milza congestionata diffusa con scarso numero di follicoli linfoidi. Il centro di uno dei follicoli linfoidi rimanenti conteneva materiale fibrillare eosinofilo (fibrina) mescolato a detriti cariorretici sparsi di linfociti (linfocitolisi) (riquadro). Pochi numeri di questi linfociti contenevano 5-7 μm di corpi di inclusione intranucleare basofili che emarginavano la cromatina nucleare (freccia). (B) Gatto da pesca n. 3. Accorciamento dei villi con occasionali cripte dilatate che contenevano sostanze proteiche eosinofile e rivestite da cellule epiteliali della cripta marcatamente attenuate o necrotiche (riquadro). Molte cellule epiteliali della cripta erano picnotiche e cariorretiche e cellule rare contenevano corpi di inclusione intranucleare basofili simili (frecce). (C) Gatto da pesca n. 1. L'immunoreattività CPPV-1 è stata frequentemente osservata nel citoplasma delle cellule mononucleate nell'area del follicolo linfoide splenico. (D) Gatto da pesca n. 3. I segnali IHC CPPV-1 sono stati rilevati in modo diffuso e i segnali di immunoreattività sono stati marcatamente localizzati nel citoplasma delle cellule epiteliali criptali (riquadro). Le barre indicano 25 μm per (A) e 120 μm per (B–D).

accumuli di materiali fibrillari eosinofili al centro di tale follicolo. Pochi numeri di questi linfociti contengono 5-7 μm di corpi di inclusione intranucleare basofili che emarginano la cromatina nucleare. Nel tratto intestinale del gatto pescatore n. 3 (Fig. 1B). Alcune cripte erano dilatate e contenevano materiale proteico eosinofilo ed erano rivestite da cellule epiteliali della cripta marcatamente attenuate o necrotiche. Molte cellule epiteliali criptiche erano picnotiche e cariorretiche e cellule rare contenevano corpi di inclusione intranucleare basofili simili. CPPV-1 IHC è stato utilizzato per dimostrare la presenza del virus nei tessuti e per descrivere il ruolo patologico di CPPV-1 nelle lesioni osservate nell'esame post mortem di routine. Le cellule mononucleate residenti nella milza hanno rivelato un'intensa immunoreattività positiva di CPPV-1 in tutti i gatti da pesca (Fig. 1C). L'immunoreattività è stata osservata anche nella maggior parte del citoplasma delle cellule epiteliali criptate ed era compatibile con le lesioni intestinali del gatto pescatore n. 3 (Fig. 1D). In particolare, vari gradi ditubulare renalevacuolizzazione e multifocalerenalel'emorragia era evidente in tutti i gatti da pesca (Fig. 2A). Alcunirenalele cellule epiteliali tubulari erano ipereosinofile con picnosi nucleare, mentre le rare cellule epiteliali tubulari vacuolate rivelavano nuclei vescicolati con cromatina nucleare marginale (Fig. 2B). Per quanto riguarda larenelesioni, abbiamo ulteriormente eseguito la colorazione PAS per dimostrare l'architettura cellulare ditessuto renaleed escludere l'ipossia sistemica come possibile causa di questa lesione. La colorazione PAS ha dimostrato iltubulare renalele membrane basali erano intatte (Fig. 2B, riquadro). All'interno delrenesezioni, l'immunomarcatura CPPV-1 era forte e frequentemente osservata nel citoplasma ditubulare renalecellule epiteliali (Fig 2C) e cellule uroteliali albacino renalein tutti i casi. Nessuna evidenza di reazione immunogenica è stata osservata nei controlli negativi (S1 Fig). La localizzazione atipica del CPPV-1 intessuti renalirivelato da IHC ha suggerito di condurre ulteriori indagini per confermare la presenza e la localizzazione del CPPV-1 inreneutilizzando ISH e TEM con tecnica pop-off. L'immunoreattività CPPV-1 ISH è risultata positiva in tutti i gatti da pesca e diffusamente localizzata nel nucleo direnalecellule epiteliali tubulari, dove sono state osservate le lesioni tubulari (Fig 2D). Nessuna reazione è stata osservata nei controlli negativi (S1 Fig.) In accordo con i risultati dei segnali immunologici positivi di ISH che si sono localizzati nel nucleo direnalesono state osservate cellule epiteliali, numerose piccole particelle virali ad alta densità di elettroni, stimate in circa 19-22 nm di diametro. Questi erano raggruppati nei nuclei di questitubulare renalee cellule uroteliali (Fig. 3).

Rilevamento del CPPV del gatto da pesca-1 e analisi genomicaIn primo luogo, sui campioni estratti di acido nucleico virale sono stati testati i pannelli PCR pan-famiglia specifici per vari virus tra cui herpesvirus, paramyxovirus, pneumovirus, calicivirus, virus dell'influenza, bocavirus, coronavirus e parvovirus. Ciò ha rivelato risultati positivi solo con la PCR pan-parvovirus nell'intestino, nei linfonodi erenecampioni dei tre gatti da pesca. Al contrario, altre pan-PCR per le altre rilevazioni di virus sono risultate negative in tutti i campioni di tessuto testati. Dai risultati ottenuti in precedenza di positività per pan-parvovirus PCR in tutti i gatti da pesca, abbiamo ulteriormente caratterizzato le sequenze del genoma codificante in due gatti da pesca utilizzando diverse coppie di primer nel campioni estratti di acido nucleico ottenuti dall'intestino (caso n. 1) erene(caso n.3). Le 4.462 e 4.430 coppie di basi di genomi codificanti completi di due ceppi CPPV{5}} di gatti da pesca sono state rilevate e sono state designate come ceppo 19ZP004-TH/2019 (caso n. 1, n. di accesso MW145540) e 19ZP{ {12}}TH/2019 (caso n. 3, n. di adesione MW145541), rispettivamente. Dopo l'analisi genetica, i genomi codificanti completi hanno rivelato risultati geneticamente simili tra i ceppi CPPV-1 ottenuti da gatti da pesca, dimostrando che questi gatti da pesca CPPV-1 erano FPV. Il confronto degli aminoacidi dedotti tra le varianti CPPV-1 e i gatti da pesca FPV sono descritti nella Tabella 1. Da notare che il gatto da pesca FPV ha rivelato mutazioni amminoacidiche uniche di I566M e M569R nella proteina strutturale (VP1 e 2) , che non sono stati rilevati nelle precedenti varianti CPPV-1.

Fig 2. Infezione da CPPV-1 nei gatti da pesca. Fotomicrografie dimostrative di H&E (A), colorazione PAS (B), CPPV-1 IHC (C) e ibridazione in situ (ISH) (D) direnedai gatti da pesca. (A, B) Gatto da pesca n.3. (A) Multifocalerenaleemorragia contubulare renalevacuolizzazione. Poche cellule epiteliali tubulari erano ipereosinofile con nuclei picnotici (riquadro, frecce). (B)Tubolare renalele cellule epiteliali hanno mostrato il vacuolo citoplasmatico ei nuclei delle cellule epiteliali rare sono vescicolati con cromatina nucleare marginale. La colorazione PAS ha evidenziato la membrana basale intatta (riquadro). (C) Gatto da pesca n. 2. L'immunoreattività IHC per CPPV-1 (colore marrone scuro) è stata osservata in modo diffuso neltubuli renalie frequentemente rilevato nel citoplasma ditubulare renaleepitelio (riquadro). (D) Gatto da pesca n.1. CPPV-1 L'immunoreattività ISH (colore rosa rossastro) è stata ampiamente osservata intubuli renali(asterischi), ed è localizzato nei nuclei ditubulare renaleepiteli (riquadro, frecce). Le barre indicano 50 μm per (A, C) e 120 μm per (B, D).

Analisi filogenetica ed evolutivaPer confrontare la relazione genetica tra il CPPV del gatto pescatore rilevato-1 e altri genomi CPPV-1 precedentemente pubblicati, è stata condotta un'analisi filogenetica basata sulla sequenza completa del genoma codificante. L'albero filogenetico ML ha mostrato che la maggior parte di FPV, MEV e CPV formavano un clade molto distinto tra i gruppi (Fig. 4). I due genomi CPPV-1 dei gatti da pesca studiati (indicati da triangoli rossi) sono stati raggruppati insieme con lo stesso lignaggio di sequenze FPV precedentemente pubblicate ottenute da vari ospiti, confermando che il

Fig 3. Particelle virali CPPV-1 nel nucleo ditubulare renalecellule epiteliali. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) con tecnica pop-off. Dimostrazione ultrastrutturale del raggruppamento di particelle elettron-dense (frecce). La dimensione delle particelle icosaedriche era di 19-22 nm di diametro situata nel nucleo ditubulare renalecellule epiteliali (riquadro). Barre di scala come mostrato nella figura.

I CPPV del gatto da pesca{0}} erano FPV. I genomi rilevati sono stati raggruppati insieme e più strettamente correlati al genoma FPV rilevato nei gatti domestici in Thailandia (accesso n. MN127780). Per chiarire ulteriormente il processo evolutivo del gatto pescatore rilevato CPPV-1, sono stati condotti numerosi rilevamenti di ricombinazione e analisi evolutive su un set di dati di 224 sequenze genomiche complete CPPV-1. L'analisi di ricombinazione ha rivelato che non sono stati trovati eventi di ricombinazione nelle sequenze CPPV del gatto pescatore-1. L'albero evolutivo di questi dati ha mostrato due principali distinti cladi separati (Fig. 5). Un clade includeva FPV e MEV e un altro clade includeva tutte le sequenze CPV. Il tasso evolutivo complessivo è stato stimato a 1,08 × 10-4 sostituzioni/sito/anno (95% HPD: 1,95–2,87 × 10-4). L'albero evolutivo ha mostrato che le sequenze di FPV del gatto da pesca erano raggruppate nello stesso lignaggio di FPV di quello isolato dalla Thailandia. Hanno condiviso l'evoluzione genetica con i genomi FPV rilevati nei gatti domestici in Cina e potrebbero avere la stessa origine dal 1970 circa.

Discussione

Circolazione di varianti CPPV-1 che include CPV e FPV sono state identificate sia nei carnivori domestici che selvatici. Sebbene l'infezione fatale da CPPV-1 nei cani e nei gatti domestici sia comune, questa infezione si osserva sporadicamente nei carnivori selvatici [46]. Diversi studi hanno indicato che molti carnivori selvatici sono suscettibili all'infezione da CPPV-1 inclusi felini selvatici, visoni, lontre, puzzole, procioni, volpi, lupi, coyote, zibetti e faine [11, 19]. In particolare per il genere Prionailurus, è stato segnalato che solo i gatti leopardo sono stati infettati da varianti CPPV-1 [9]. In questo studio, descriviamo l'infezione naturale di FPV, un membro di CPPV-1, nei gatti pescatori selvatici (Prionailurus viverrinus). Questo è il primo rapporto con una descrizione della distribuzione virale e del tropismo distinti intessuti renalicome confermato tramite rilevamento antigenico mediante analisi PCR, IHC, ISH e TEM dell'ultrastruttura.

È stata osservata la trasmissione tra specie di varianti di CPPV-1 tra carnivori domestici e selvatici e si è ipotizzato che alcuni focolai fatali di CPPV-1 siano associati allo spillover di agenti patogeni tra gli habitat [9, 11]. A causa dell'attuale perdita dell'habitat della fauna selvatica, le colonie selvatiche sono migrate e hanno condiviso gli habitat con gli animali domestici, il che ha portato a una maggiore diffusione di agenti patogeni tra gli animali sensibili. In questo studio, abbiamo scoperto che i genomi del gatto pescatore CPPV-1 hanno condiviso un modello evolutivo con i ceppi di FPV rilevati in

Fig 4. Topologia filogenetica che rivela la relazione genetica delle sequenze codificanti a lunghezza intera tra il gatto pescatore CPPV-1 e altre varianti di CPPV-1. L'albero filogenetico ha mostrato che le sequenze del gatto pescatore CPPV-1 (indicate da triangoli rossi) erano raggruppate insieme ai genomi FPV con il genoma più correlato al genoma FPV rilevato nel gatto thailandese (MN127780). Sono stati indicati i numeri di accesso GenBank delle sequenze CPPV-1 precedentemente descritte utilizzate in questa analisi.

gatti domestici in Thailandia. Questi risultati mostrano un modello evolutivo simile ai ceppi FPV di antenati comuni isolati dai gatti domestici in Cina dagli anni '70. Questo risultato può implicare una possibile prova di trasmissione tra specie diverse tra gatti domestici e gatti da pesca o una coevoluzione delle varianti CPPV-1. Tuttavia, a causa della limitazione dei campioni ottenuti da animali in libertà negli stessi habitat e del piccolo numero di gatti da pesca studiati, in questo studio non è stato possibile identificare il serbatoio principale del CPPV-1 e sono necessarie ulteriori indagini . Sebbene diversi studi abbiano indicato che vari residui di amminoacidi nel gene del capside sono associati sia alla capacità di infettare nuovi ospiti che all'antigenicità di CPPV-1 [18, 47], la singola mutazione amminoacidica in posizione 300 del la proteina del capside (VP2) è stata segnalata come un determinante chiave per più intervalli di host [48]. In questo studio, la variante CPPV-1 ottenuta dai gatti da pesca ha rivelato gli stessi schemi aminoacidici che si trovano nelle sequenze FPV, con la presenza di alanina (A) come determinante amminoacidico chiave nella posizione del capside 300. Mentre la proteina del capside del gatto pescatore di CPPV-1 ha rivelato aminoacidi asparagina (N) e alanina (A) situati rispettivamente nelle posizioni 564 e 568 (che sono considerati critici per la replicazione dell'FPV nell'ospite felino), avevano 2 mutazioni di amminoacidi uniche nelle posizioni I566M e M569R. Queste mutazioni possono differenziare questo virus dalle varianti CPPV{20}} precedentemente descritte. Un'analisi precedente della ricostruzione ancestrale ha rilevato che FPV può infettare carnivori distinti con pochi cambiamenti nel gene VP2 [49]. Pertanto, il parvovirus simile a FPV è stato provvisoriamente nominato come un virus potenzialmente nuovo rilevato nei gatti da pesca e questo potrebbe supportare la prima identificazione di questo virus in questa specie. Tuttavia, un piccolo numero di gatti da pesca studiati rispetto a un piccolo numero di altre sequenze potrebbe non fornire un'interpretazione definitiva. Ciò ha bisogno di ulteriori studi per trarre conclusioni più precise.

Sono state osservate localizzazioni di CPPV{0}} del gatto pescatore in vari tessuti, comprese le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi, dove la localizzazione tissutale più comune dell'infezione da CPPV-1 si trova in altre specie [20, 26, 50, 51 ]. È interessante notare che poiché l'indagine iniziale sul rilevamento genomico virale mediante PCR e la localizzazione virale mediante IHC ha rivelato una localizzazione virale distinta intessuti renali, abbiamo eseguito la colorazione PAS per dimostrare l'architettura cellulare ditessuto renalee per escludere l'ipossia sistemica come possibile causa di necrosi tubulare. La colorazione PAS ha rivelato che la maggior parte delle membrane basali tubulari erano intatte, suggerendo che questa lesione potrebbe non derivare da ipossia sistemica [52]. Tuttavia, altre cause come la necrosi tubulare indotta da tossine possono causare questa lesione. Pertanto, il ruolo dell'infezione da parvovirus simile a FPV associato arenelesioni necessitano ancora di ulteriori indagini. Inoltre, abbiamo tentato di chiarire ulteriormente la localizzazione esistente del virus intessuto renaleutilizzando ISH e TEM con la tecnica pop-off [37] nelle aree in cui è stata rilevata l'immunoreattività CPPV-1 IHC. Le particelle elettron-dense sono state osservate nel nucleo ditubulare renalecellule epiteliali e cellule uroteliali, che supportano l'immunoreattività in situ positiva di CPPV-1 intessuto renale. I gatti infetti da FPV perdono il virus principalmente nelle feci, ma è stata descritta la presenza di virus attivo nelle urine [53, 54]. Studi recenti hanno indicato che l'infezione da parvovirus ha un ruolo nelinsufficienza renale[55]. Tuttavia, la localizzazione di FPV e della controparte CPV neltessuto renalenon è stato precedentemente indagato. Inoltre, un toporeneparvovirus (MKPV) ha dimostrato di essere un virus nefrotropico mostrando un'affinità per infettare e localizzare intubulare renalecellule epiteliali, con conseguentemalattie renali [56, 57].

Sulla base delle nostre conoscenze, la localizzazione CPPV-1 nelreninon è stato precedentemente descritto. Ciò suggerisce la nuova descrizione di una localizzazione virale unica in questa specie o anche se può essere trovata nei gatti infetti da FPV. Questo risultato può supportare studi precedenti che hanno trovato FPV nelle urine. Reperti patologici unici possono essere soggettivi e possono essere osservati come infezione negli individui. Pertanto, un'indagine su larga scala sul CPPV del gatto da pesca-1 faciliterà un'interpretazione definitiva. Inoltre, i campioni che sono stati inviati principalmente da animali morti ed erano già stati sottoposti ad autolisi post mortem non sono adatti per ulteriori prelievi di organi da questi animali. Quindi non siamo stati in grado di determinare la localizzazione virale in altri organi. Il chiarimento della localizzazione virale atipica del gatto pescatore CPPV-1 sarebbe un'indagine utile.

CISTANCHE MIGLIORA LA MALATTIA RENALE/RENALE

CPPV-1 è stato identificato in vari carnivori selvatici ed è associato a focolai mortali. L'evidenza negativa del rilevamento retrospettivo di CPPV-1 in campioni di animali selvatici in questo studio può derivare dall'assenza di uno stretto contatto tra animali sensibili o, d'altra parte, dalla conservazione prolungata del campione che influisce sulla stabilità dei materiali genomici. La nuova identificazione di CPPV-1 associata all'infezione mortale dei gatti pescatori in questo studio solleva preoccupazioni su una nuova malattia potenzialmente virulenta in questo animale vulnerabile. Pertanto, un ulteriore studio della trasmissione di CPPV-1 nei gatti da pesca è essenziale per prevenire la perdita di altre specie animali sensibili. Di conseguenza, le strategie di prevenzione dovrebbero essere enfatizzate al fine di gestire le infezioni da CPPV-1, non solo in questa specie ma anche negli animali domestici in libertà che possono fungere da potenziali ospiti per questo virus.