La nicotina aggrava il danno renale indotto da tacrolimus mediante la morte cellulare programmata
Mar 23, 2022
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Yu Ji Jiang, Sheng Cui, Kang Luo, Jun Ding
INTRODUZIONE
Nonostante la scoperta di nuovi immunosoppressori, il tacrolimus (TAC) rimane la pietra angolare dei regimi immunosoppressori nel trapianto di organi solidi. Tuttavia, l'uso a lungo termine di TAC aumenta il rischio di effetti avversi (p. es., nefrotossicità, neurotossicità, infezioni, tumori maligni, diabete e disturbi gastrointestinali) [1]. Tra questi, acutorenelesioneo nefrotossicità cronica da TAC è stata segnalata nel 46% dei trapiantati di polmone [2] e nel 22,4% dei trapiantati di rene [3]. Mentre acutorenelesioneè considerato reversibile dopo la riduzione della dose di TAC o una sospensione completa, la nefrotossicità cronica, che porta alla perdita dell'allotrapianto, è irreversibile. La nefrotossicità cronica da TAC è caratterizzata da glomerulopatia, ialinosi delle arteriole afferenti e fibrosi tubulointerstiziale striata (TIF) [4]. Sebbene l'esatto meccanismo di questo dilemma clinico rimanga sconosciuto, abbiamo recentemente dimostrato che l'infiammazione originata dallo stress ossidativo, il fattore di crescita trasformante 1 (TGF- 1) e la morte cellulare programmata possono essere attori importanti [5]. Il fumo di sigaretta è una sfida critica per la salute pubblica e un onere finanziario per la società che riduce la qualità della vita. Rapporti epidemiologici mostrano che attualmente ci sono più di un miliardo di fumatori di sigarette nel mondo e sei milioni di decessi ogni anno a causa del consumo di tabacco. Questi tassi sono entrambi in aumento, in particolare nei paesi in via di sviluppo o sottosviluppati [6]. È noto che il fumo di sigaretta è un fattore di rischio per vari tipi di cancro, eventi cardiovascolari (infarto del miocardio e ictus) e malattie polmonari ostruttive. Nel rene, il fumo aumenta la gravità della disfunzione renale nei pazienti con diabete, ipertensione, policisticorenepatologia, e post-trapianto di rene [7]. Inoltre, il fumo può anche causare danni renali de novo anche in una popolazione sana senza una malattia renale cronica (CKD) preesistente [8]. Questo studio ha cercato di valutare: (1) senicotina(NIC), una componente tossica primaria del fumo di sigaretta, aggrava il danno renale indotto da TAC; e, in tal caso, (2) quale meccanismo tiene conto di NIC(nicotina)-nefrotossicità accelerata.
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RISULTATI
Effetto di NIC(nicotina)sui parametri di base
La tabella 1 delinea gli effetti di NIC(nicotina)sui parametri di base nei gruppi sperimentali. Entrambi NIC(nicotina)e TACincrease UV (poliuria), che è stato ulteriormente aumentato da NIC(nicotina)e trattamento TAC. Né NIC(nicotina)né il TAC hanno impedito la perdita di BW. L'escrezione di proteine urinarie, Scr, BUN e Cys-C erano notevolmente superiori in entrambi i NIC(nicotina)e gruppi TAC rispetto al gruppo VH; questi livelli sono ulteriormente aumentati con la combinazione dei due farmaci, il che implica che NIC(nicotina)accelera la disfunzione renale indotta da TAC. Non ci sono state differenze significative tra i gruppi di SBP. Il trattamento con TAC di quattro settimane ha aumentato la concentrazione di TAC nel sangue a 11.0±og ng/mL, mentre il NIC(nicotina) did not influence blood TAC concentration(12.8±15 ng/mL,p>o.o5 vs. TAC). Inoltre, il trattamento di ratti normali con NIC(nicotina)con conseguente aumento della concentrazione di cotinina nel siero e nelle urine rispettivamente di 56,5±17 ng/mL e 8;6±192,6 ug/giorno. Queste concentrazioni di cotinina nel siero e nelle urine imitano quelle osservate negli esseri umani che sono fumatori attivi [13].
Tabella 1. Effetto di NIC(nicotina)sui parametri funzionali
Effetto di NIC(nicotina)sull'istopatologia nella nefrotossicità cronica da TAC
La nefrotossicità cronica da TAC è caratterizzata da caratteristiche istologiche uniche tra cui TIF a strisce e glomerulopatia. Mediante la colorazione istologica e la microscopia elettronica, abbiamo scoperto che il danno glomerulare causato da TAC si manifesta con l'ispessimento del seminterrato glomerulare e l'annullamento dei processi del piede dei podociti (Fig. IA, IC e D), questo può collegarsi all'aumento dell'escrezione proteica nelle urine. Su analisi quantitative, sia NIC(nicotina)e TAC ha aumentato l'area mesangiale frazionaria, con un ulteriore aumento osservato nel NIC(nicotina)e gruppo TAC. I principali cambiamenti nella nefrotossicità cronica da TAC erano confinati alle aree tubulo-interstiziali, come delineato dalla deposizione fibrosa tubulo-interstiziale, dall'atrofia tubulare e dalla fibrosi striata (Fig. 1B, 1E e F). Le cifre mostrano chiaramente che il punteggio TIF nella NIC(nicotina)più il gruppo TAC era superiore rispetto a entrambi i NIC(nicotina)gruppo o il gruppo TAC.
Figura 1. Micrografie rappresentative dell'acido periodico-Schiff(PAS)(A), Masson tricromo (B), microscopia elettronica a trasmissione (CF) e analisi quantitativa della lesione glomerulare e della fibrosi tubulo-interstiziale (TIF); (C) ispessimento della membrana basale glomerulare (frecce); (D) cancellatura del piede podocita processi (frecce);(E)rigonfiamento del tubulointerstizio e ampia deposizione di collagene (scatter);(F) tubuli atrofizzati (frecce).VH, veicolo; NIC(nicotina), nicotina; TAC, tacrolimo. p
Effetto di NIC(nicotina)sull'espressione di citochine profibrotiche nella nefrotossicità cronica da TAC
Il presente studio ha cercato di confrontare l'espressione della citochina profibrotica TGF- 1 e CTGF e la componente della matrice extracellulare (ECM) di ig-h; tra i gruppi sperimentali. Coerentemente con i risultati del TIF, NIC(nicotina)sovraespressione aumentata indotta da TAC di TGF pro-fibrotico- 1 e CTGF ed ECM ig-h3 (Fig.2)
Figura 2. Micrografie rappresentative dell'analisi immunoblottingper (A) fattore di crescita trasformante 1 (TGF-B1), (B TGF- - gene-h( ig-h3) indotto e (C) fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF). Sono rappresentati i valori per l'espressione proteica utilizzando il gruppo del veicolo (VH) come riferimento del 100% e normalizzato in -actin.NIC(nicotina), nicotina;TAC, tacrolimo. 3p
Effetto di NIC(nicotina)sull'infiammazione nella nefrotossicità cronica da TAC
Per definire l'effetto di NIC sull'infiammazione nel danno renale indotto da TAC, abbiamo studiato l'espressione di mediatori proinfiammatori e geni correlati alla pirotosi mediante immunoblotting e immunoistochimica. La Fig. 3 ha mostrato che il trattamento con TAC sovraregola l'espressione delle citochine correlate alla piroptosi (ⅡL-1, IL{5}} e NLRP3) e MCP-1, risultando in ED-1-positivo infiltrazione cellulare e ulteriori aumenti sono stati trovati da un trattamento combinato di NIC(nicotina)e TAC.
Figura 3. Micrografie rappresentative dell'immunoistochimica per la displasia ectodermica-1 (DE-1)(A) e analisi immunoblot per citochine proinfiammatorie (B). VH, veicolo; NIC(nicotina), nicotina; TAC, tacrolimo; MCP-1, proteina chemiotattica dei monociti-1;IL, interleuchina; NLRP3, proteina contenente il dominio pirina del recettore simile a NOD3. p
Effetto di NIC(nicotina)sullo stress ossidativo nella nefrotossicità cronica da TAC
Come mostrato in Fig.4, cronico(nicotina)Il trattamento con TAC è strettamente associato a uno squilibrio tra enzimi ossidanti e antiossidanti [12,14. L'analisi di immunoblotting ha mostrato che NIC sovraregolava l'espressione NOX-2 e NOX{4}} indotta da TAC ma sopprimeva le espressioni SOD1 e SOD2. Inoltre, i livelli sierici e urinari di 8-OHdG, un marker di stress ossidativo, erano più elevati nei gruppi NIC e TAC rispetto al gruppo VH e più alti nel gruppo NIC più TAC. Questi risultati implicano un effetto sinergico di NIC e TAC sullo stress ossidativo in questo modello.
Figura 4. Microfotografie rappresentative dell'analisi immunoblotting di una serie di proteine correlate allo stress ossidativo (A) e siero (B) e urinario (C)Concentrazioni di 8-idrossi{1}}'-deossiguanosina (8-OHdG). VH, veicolo; NIC(nicotina), nicotina; TAC, tacrolim-us; SOD, superossido dismutasi; NOX,NADPH ossidasi.Bp
Effetto di NIC(nicotina)sulla morte cellulare programmata nella nefrotossicità cronica da TAC
La morte cellulare programmata di tipo I (apoptosi) o di tipo II (autofagia) è coinvolta nella patogenesi del danno renale cronico indotto da TAC [1s]. Usando il test TUNEL, abbiamo osservato che la maggior parte delle cellule TUNEL-positive o dei corpi apoptotici erano localizzate nelle cellule epiteliali tubulari e nelle cellule endoteliali vascolari interstiziali, dove l'atrofia tubulare e il tipico TIF progredivano (Fig.5A). L'analisi quantitativa ha mostrato che entrambi NIC(nicotina) e TAC hanno aumentato significativamente le cellule TUNEL-positive rispetto ai gruppi VH; questo era più pronunciato nel gruppo NIC più TAC. A livello molecolare, l'aggiunta di NIC(nicotina)ai ratti trattati con TAC ha provocato una disregolazione significativa dell'espressione di Bcl-2/Bax e la caspasi scissa{2}} verso la morte cellulare (Fig. 5B). Inoltre, la microscopia elettronica ha mostrato che il trattamento con TAC ha indotto un'abbondante formazione di compartimenti autofagici, come i vacuoli autofagici iniziali (AVi), i vacuoli autofagici degradativi (Avd) e la mitofagia (una forma di autofagia selettiva) nel NIC, TAC e NIC più gruppi TAC (Fig. 6). L'immunoblotting quantitativo ha rivelato che la sovraespressione delle proteine p62, LC3B, PINK1 e Parkin osservata nei reni di ratto trattati con TAC era ulteriormente aumentata con NIC (Fig. 6G e 6H).
Figura 5. Micrografie rappresentative del saggio di etichettatura (TUNEL) di dUTP-biotina nick end mediato da TdT(A) e analisi immuno-blotting per i geni che controllano l'apoptosi (B).Nicotinail trattamento aumenta le cellule TUNEL-positive (frecce) nei reni di ratto trattati con tacro-limus.VH, veicolo; NIC(nicotina),nicotina; TAC,tacrolimus; Bcl, linfoma a cellule B; Bax, Bcl2-associato X. p
Effetto di NIC(nicotina)sulla disfunzione mitocondriale nella nefrotossicità cronica da TAC
Con la microscopia elettronica a trasmissione, abbiamo chiaramente osservato che entrambi NIC(nicotina)e TAC hanno distrutto le architetture mitocondriali, come illustrato dalla riduzione delle dimensioni e dal numero dei mitocondri, dalle creste disorganizzate, dalla vacuolizzazione, dalla fusione, dalla formazione della mitofagia e dai mitocondri divisi in due o tre fissioni di organelli figlie) (Fig.6). I risultati dell'analisi quantitativa hanno mostrato che NIC(nicotina) il trattamento ha ulteriormente ridotto il numero e la dimensione dei mitocondri rispetto al solo trattamento NIC o TAC. L'analisi dell'immunoblotting ha rivelato che la disregolazione delle proteine mitocondriali (OPA1 e Drpi) indotte da Nicor TAC è stata esacerbata dalla co-somministrazione di NIC e TAC (Fig. 6).
Figura 6. Micrografie elettroniche a trasmissione rappresentative dell'autofagia e della morfologia mitocondriale(AF), analisi di immunoblot (G, H) e quantificazione del numero e delle dimensioni dei mitocondri in ciascun gruppo di trattamento. (A) Formazione di autofagia nei reni di tacrolimus (TAC) e/onicotina(NIC) ratti trattati (freccia);(B) un compartimento autofagico contenente mitocondri i reni di 'TAC e/o NIC(nicotina)ratti trattati (mitofagia, freccia); (C) mitocondri normali; (D) numero mitocondriale ridotto nei reni di TAC e/o NIC(nicotina)ratti trattati;(E) fusione mitocondriale osservata nei reni di ratti trattati con TAC e/o NIC (cerchio);(F) mitocondrio diviso in due o più organelli figli nei reni di ratti trattati con TAC e/o NIC (fissione, cerchio) . VH, veicolo;LC3B, catena leggera 3B; PINK1, fosfato e omologo di tensione deleti sulla chinasi 1 indotta dal cromosoma dieci; OPA, proteina di atrofia ottica; Drp, proteina correlata alla dinamina.p
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Effetto di NIC(nicotina)sullo stress del reticolo endoplasmatico nella nefrotossicità cronica da TAC
Come mostrato in Fig.7, Nicor TAC ha indotto la degranulazione dei ribosomi, cisterne disconnesse e dilatate e la vacuolizzazione del perossisoma nel reticolo endoplasmatico ruvido (ER), mentre la struttura liscia dell'ER è rimasta quasi normale (Fig.7B). L'analisi dell'immunoblotting ha rivelato che entrambi i NIC(nicotina)o TAC ha aumentato l'espressione dei geni correlati allo stress ER inclusi CHOP, Bip, IRE-1 e ATF-6, ma la loro espressione è stata ulteriormente aumentata dalla combinazione dei due (Fig.7C).
Figura 7. Micrografie rappresentative della microscopia elettronica a trasmissione (A, B) e dell'analisi immunoblotting dei geni correlati allo stress del reticolo endoplasmatico (ER) (C).(A) ER ruvido normale (frecce); (B) degranulazione dei ribosomi, cisterne disconnesse e dilatate e dilatazione delle vescicole di ER ruvido innicotina(NIC) e/o rene di ratto trattato con tacrolimus (TAC). VH, veicolo;CHOP, proteina omologa C/EBP;Bip, proteina immunoglobulinica legante; IRE-1c,proteina che richiede inositolo-1c; ATF, fattore di trascrizione attivante. p< o.01="" vs.vh,="">
DISCUSSIONE
Il fumo di sigaretta è un importante fattore di rischio modificabile per la progressione dell'insufficienza renale cronica sia nelle popolazioni sane che nei pazienti con malattie sottostanti (p. es., diabete, ipertensione). Gli studi clinici dimostrano che il fumo di sigaretta aumenta l'escrezione urinaria di albumina e influisce negativamente sulla funzione renale [16]; inoltre, smettere di fumare può migliorare la proteinuria nei pazienti con insufficienza renale cronica e diabete di tipo 2 e rallentare la progressione verso la malattia renale allo stadio terminale[1-,18]. Inoltre, il fumo del ricevente o del donatore contribuisce a episodi di rigetto e nefropatia cronica da allotrapianto, portando alla perdita dell'allotrapianto nel trapianto di rene [19,2o]. Questi effetti deleteri del fumo (NIC(nicotina))sono rispecchiati da studi su modelli di roditori di nefrectomia s/6[2al e nefropatia diabetica [o]. Nel presente studio, abbiamo trovato che NIC(nicotina)area mesangiale frazionaria indotta da TAC aggravata e TIF. Questi cambiamenti patologici hanno portato a una compromissione della funzione renale più pronunciata e all'aumento dell'escrezione di proteine urinarie. Sulla base di questi risultati e di altri rapporti, suggeriamo che il fumo di sigaretta può accelerare la perdita di allotrapianto renale nei trapiantati che ricevono immunosoppressori a base di TAC.
L'infiammazione gioca un ruolo fondamentale nell'evoluzione della nefrotossicità cronica da ATAC perché precede la cicatrizzazione renale in corso. L'aumento dei mediatori proinfiammatori in risposta a stimoli dannosi può reclutare cellule infiammatorie, che a loro volta sovraesprimono citochine proinfiammatorie e profibrotiche come chemioattrattivi, molecole di adesione e TGF- 1. Abbiamo recentemente dimostrato che l'inflammasoma NLRP3-dipendente e indipendente è coinvolto nella patogenesi della nefrotossicità cronica da TAC [s]. I nostri risultati mostrano che la somministrazione di NIC(nicotina)ai ratti trattati con TAC amplifica l'espressione dei geni correlati alla piroptosi (NLRP3, IL-1 e I-18), dei mediatori proinfiammatori MCP-1 e delle citochine profibrotiche TGF- e CTGF, determinando all'eccessivo afflusso di cellule ED-1-positive e sovraregolazione ig-h; queste risposte riflettono la gravità delle lesioni glomerulari e tubulari. I nostri risultati sono coerenti con quelli di Arany et al.[22] e Agarwal et al.[23], che hanno mostrato gli effetti della NIC sull'infiammazione renale e sulla fibrosi.
Sebbene NIC(nicotina)l'esacerbazione basata sulla nefrotossicità cronica da TAC in questo modello può essere multifattoriale ed è probabilmente correlata all'impatto dello stress ossidativo. È noto che il trattamento cronico con TAC è strettamente associato all'ipossia correlata all'arteriolopatia afferente, che successivamente si collega allo stress ossidativo, che a sua volta attiva la sovraespressione profibrotica del TGF- 1, portando alla fibrosi. Questo costrutto è supportato dall'osservazione che le terapie antiossidanti (ad es. il coenzima Q10) attenuano l'espressione di TGF- 1 e il TIF preservando l'integrità mitocondriale nella nefrotossicità cronica da TAC 24]. Recentemente, prove schiaccianti provenienti da studi in vitro dimostrano un'interrelazione tra esposizione cronica a NIC e stress ossidativo in una varietà di lesioni renali [o,25,26. Qui, abbiamo scoperto che il NIC aumenta i livelli sierici e urinari di 8-OHdG e aumenta l'espressione della proteina ossidante, mentre sopprime l'espressione della proteina antiossidante, aumentando così lo stress ossidativo indotto da TAC e la fibrosi. In effetti, l'aggravamento della NIC dei reni trattati con TAC in questo studio può essere attribuito allo stress ossidativo.
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È anche possibile che sia l'apoptosi (morte cellulare programmata di tipo I) che l'autofagia (morte cellulare programmata di tipo II) siano coinvolte nella NIC(nicotina)-nefrotossicità cronica accelerata da TAC. Come precedentemente illustrato, la NIC induce direttamente l'apoptosi dei podociti e delle cellule del tubulo prossimale renale [27,28]; induce anche indirettamente la morte cellulare apoptotica tramite stress ossidativo[2g] o attivazione del TGF- 1[22].NIC(nicotina)può anche indurre l'autofagia nelle cellule stellate del pancreas Bo], nei miociti cardiaci di topo neonatale 31] e nelle cellule muscolari lisce vascolari 32]. Pertanto, lo stress ossidativo e la morte cellulare programmata sono correlati. Utilizzando il test TUNEL e la microscopia elettronica, abbiamo chiaramente osservato che NIC ha aumentato significativamente il numero di cellule TUNEL-positive nelle cellule epiteliali tubulari, nelle cellule endoteliali vascolari interstiziali e nei compartimenti autofagici nei reni di ratto trattati con TAC. Questi cambiamenti morfologici sono stati accompagnati da disregolazione dei geni correlati all'apoptosi o all'autofagia nei reni di ratto, portando alla morte cellulare. Questa evidenza cumulativa suggerisce che NIC(nicotina)di per sé non solo induce stress ossidativo e morte cellulare programmata, ma promuove anche l'effetto avverso della TAC sul rene, con conseguente disfunzione renale e danno architettonico, come precedentemente riportato in modelli di nefropatia diabetica indotta da streptozotocina (STZ) [o] e CKD ( s/6 nefrectomia) B3].
Inoltre, gli organelli intracellulari originati dallo stress ossidativo come la disfunzione mitocondriale e lo stress ER svolgono un ruolo fondamentale nell'integrità della nefrotossicità cronica da TAC, innescano lo stress ER e disregolano i geni mitocondriali e di controllo dello stress ER e gli effetti sono peggiorati dal trattamento combinato con i due . Pertanto, il deterioramento dell'idoneità mitocondriale e lo stress ER possono spiegare l'effetto della NIC(nicotina) sul danno renale indotto da TAC
Il nostro studio ha rivelato che NIC(nicotina)a una dose di 15 mg/kg aggrava il danno renale indotto da TAC attraverso stress ossidativo, infiammazione e morte cellulare programmata, coerentemente con studi precedenti [27,37,38]. Tuttavia, altri hanno osservato risultati opposti. Sadis et al.Bg] hanno dimostrato che NICat a una dose di mg/kg ofos protegge il rene dal danno da ischemia/riperfusione attraverso la via antinfiammatoria colinergica. Un altro studio di Agarwal et al.[23] ha riferito che il trattamento orale a lungo termine con NIC(nicotina)(28 settimane) conferisce effetti renoprotettivi in un modello di ratto di proteinuria spontanea (ratti Monaco-Wistar-Frömter). Le ragioni di questa discrepanza nel ruolo della NIC sul rene sono sconosciute, ma possono dipendere dalla dose di NIC, dalla durata del trattamento farmacologico o dal modello di roditore. Sono necessari ulteriori studi per risolvere questi problemi. Questo studio dimostra chiaramente che il NIC esacerba il danno renale indotto da TAC in un modello di ratto di nefrotossicità cronica da TAC. L'aggravamento dello stress ossidativo e la morte cellulare programmata possono essere un meccanismo alla base degli effetti deleteri della NIC. I nostri risultati forniscono una maggiore comprensione degli impatti del fumo tra i trapiantati.
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