Parte 1: Istituzione del modello sperimentale concomitante di osteoporosi combinato con la malattia di Alzheimer nel ratto e i doppi effetti di echinacoside e acteoside da Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
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Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ASTRATTO
Rilevanza etnofarmacologica: Cistanche tubulosa |è una preziosa medicina tradizionale cinese che è stata ampiamente utilizzata nel trattamento dell'osteoporosi eMorbo di Alzheimer.Echinacosidee acteoside sono i principali costituenti attivi in Cistanche tubulosa che hanno attività farmacologiche con valore di ricerca. È stato riportato che echinacoside eacteosidepotrebbe migliorare l'apprendimento e la capacità di memoria, promuovere la proliferazione e la differenziazione degli osteoblasti. Scopo dello studio: Echinacoside e acteoside daCistanche tubulosa |hanno mostrato attività significative di anti-osteoporosi e anti-morbo di Alzheimer, mentre questi effetti non sono stati studiati contemporaneamente in un modello di ratto. Lo scopo di questo studio è stato quello di stabilire e verificare il modello di osteoporosi combinato conMorbo di Alzheimernei ratti e per studiare i doppi effetti diechinacosidee acteoside su questo modello concorrente.
Materiali e metodi:Tre gruppi modello di ovariectomia (OVX), chirurgia fittizia con D-galattosio e AlCl3 (D), ovariectomia con D-galattosio e AlCl3 (OVX + D) sono stati impostati contemporaneamente. I ratti nei gruppi di trattamento farmacologico sono stati ovariectomizzati. Durante l'iniezione intraperitoneale di D-galattosio e la somministrazione intragastrica di AlCl3 nei ratti dei gruppi di trattamento farmacologico, i ratti sono stati somministrati per via oraleechinacoside(90 mg/kg/giorno),acteoside(90 mg/kg/d) e i farmaci di controllo positivi di estradiolo valerato (0,6 mg/kg/d), donepezil HCl (0,8 mg/kg/d), rispettivamente. Dopo il trattamento farmacologico di 8 settimane, è stato eseguito per la prima volta il test Morris Water Maze (MWM) per 6 giorni. I ratti venivano poi sacrificati per raccogliere il sangue, l'utero, il femore, le tibie e i tessuti cerebrali. Il siero è stato utilizzato per test biochimici. Gli uteri erano usati per l'istomorfometria. I femori giusti sono stati utilizzati per Micro-CTe istomorfometria, rispettivamente. Le tibie giuste sono state utilizzate per il test biomeccanico. L'ippocampo raccolto sulla ghiacciaia è stato utilizzato per test biochimici. Il cervello 41 raccolto per perfusione è stato utilizzato per l'istomorfometria.
Risultati:Rispetto al gruppo Sham, il gruppo OVX + D potrebbe ridurre significativamente la capacità di apprendimento e memoria causando danni ossidativi, compromettendo i neuroni nell'ippocampo e influenzando l'idrolisi e la sintesi dell'acetilcolina. Nel frattempo, le attività di BALP e TRAP nel gruppo OVX+D sono aumentate significativamente (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinacosideeacteoside, le caratteristiche patologiche tipiche dell'osteoporosi eMorbo di Alzheimersono stati migliorati.
Conclusioni:Il modello di osteoporosi combinato conMorbo di Alzheimernei ratti era fattibile e stabilito con successo.Echinacosidee acteoside hanno anche mostrato alcuni effetti significativi su questo modello concorrente, e potrebbero essere potenziali 56 candidati daCistanche tubulosa |con doppi effetti per ulteriori studi.
Parole chiavi:osteoporosi; Morbo di Alzheimer; doppio effetto; echinacoside; acteoside; Cistanche tubulosa |
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1. Introduzione
L'osteoporosi è una malattia degenerativa ossea caratterizzata da una progressiva perdita di massa ossea e distruzione della microarchitettura, che può aumentare il rischio di frattura da fragilità (Rachner et al., 2011).Morbo di Alzheimer(AD) è una malattia neurodegenerativa comune negli anziani caratterizzata da continuo declino mentale, deterioramento cognitivo e perdita di capacità di vita indipendente in clinica (Reitz 76 et al., 2011). La formazione di placche senili indotta dalla deposizione di β-amiloide, dai grovigli neurofibrillari causati dall'iperfosforilazione tau e dalla degenerazione neuronale nel cervello sono le caratteristiche patologiche tipiche dell'AD (Serrano-Pozo et al., 2011). Superficialmente, OP e AD sono malattie completamente indipendenti con diverse patologie e caratteristiche cliniche. Tuttavia, OP e AD sono spesso osservati per co-verificarsi nella pratica clinica (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). La prevalenza di entrambe le malattie è aumentata con l'età, specialmente nelle donne in postmenopausa (Li et al., 2017; Stern, 2012). Sempre più prove hanno indicato che le persone con diagnosi di AD hanno un aumentato rischio di OP (Zhou et al., 2014).
È necessario studiare e chiarire le relazioni tra osteoporosi eMorbo di Alzheimerin vitro e in vivo. Prima che gli studi vengano eseguiti in vivo, è importante selezionare i modelli animali applicabili di osteoporosi o morbo di Alzheimer. Il modello di osteoporosi potrebbe essere stabilito da diversi tipi di metodi come la somministrazione intragastrica di acido retinoico, la chirurgia ovariectomia e l'iniezione intramuscolare di glucocorticoidi (Wei et al., 2007; Komori, 2015). In particolare, il modello di osteoporosi postmenopausale indotto dall'ovariectomia nei ratti era classico eè stato ampiamente utilizzato nella maggior parte degli studi (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).La malattia di Alzheimer sporadica è il tipo principale di malattia di Alzheimer. L'animalemodelli di SporadicMorbo di Alzheimerpotrebbe essere indotto da vari metodi comeiniezione di D-galattosio oβ-amiloide, somministrazione intragastrica di AlCl3,E così via(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). Inoltre, ilmodello di congiunzione della malattia di Alzheimer indotta da intraperitoneale a lungo termineanche l'iniezione di D-galattosio combinata con l'ovariectomia è stata studiata molto (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). Al fine di rivelare la rilevanza dell'osteoporosi eMorbo di Alzheimer, è necessario stabilire il modello di osteoporosi combinatocon la malattia di Alzheimer per studiare i meccanismi comuni dei farmaci suosteoporosi eMalattia di AlzheimerAse.
Cistanche tubulosa |(Schenk) Wight è una pianta parassitaria, che è distribuita principalmente nei deserti nel nord-ovest della Cina. I gambi succulenti essiccati diCistanche tubulosa |(CT) sono usati come una famosa medicina tonica chiamata Cistanches Herba con il suo nome cinese di Roucongrong nella Farmacopea cinese (2015). È stato onorato come "ginseng dei deserti" ed è ampiamente usato per i trattamenti dei dolori alla vita e al ginocchio, alla sterilità femminile e alla stitichezza nella medicina tradizionale cinese (Jiang e Tu, 2009). I principali costituenti attivi della TC sono i glicosidi feniletanoidi (PhG), l'echinacoside (ECH) eacteoside(ACT) sono i composti rappresentativi nei PhG (Morikawa et al., 2014). In particolare, ECH e ACT sono tipicamente selezionati come marcatori per il controllo di qualità nella TC a causa del loro alto contenuto e di varie attività farmacologiche come gli effetti della neuroprotezione, della protezione ossea,
antiossidanti, anti-invecchiamento e miglioramento dell'apprendimento e della capacità di memoria (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). Tuttavia, gli effetti di ECH e ACT sull'osteoporosicombinato conMorbo di Alzheimernon erano ancora stati studiati insieme in un modello di ratto.Pertanto, lo scopo di questo studio era quello di stabilire un modello di osteoporosi combinato con il ratto.con il morbo di Alzheimer ed esplorare gli effetti diechinacosidee acteoside su questomodello concorrente, in modo da fornire prove sperimentali per ulteriori studi delmeccanismo molecolare di echinacoside o acteoside nelle seguenti ricerche.
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2. Materiali e metodi
2.1. Animali
Ottanta ratti Wistar femmina di 8 settimane (numero di certificato: SCXK 2018-0006), del peso di 180 ~ 200 g, sono stati acquisiti da SINO-British SIPPR / BK Lab. Animal Ltd (Shanghai, Cina) e cresciuti nel Centro sperimentale di animali farmaceutici presso la China Pharmaceutical University.
2.2. Sostanze chimiche e reagenti
Idrato di cloralio, penicillina G sodica, D-galattosio, cloruro di alluminio esaidrato, estradiolo valerato, donepezil HCl sono stati acquistati da Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Cina).Echinacoside(HPLC 94%) è stato ottenuto da Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Cina).Acteoside(HPLC 98%) è stato acquistato da Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Cina). I kit per il dosaggio di immunossorbenti (ELISA) omostatici alcalini specifici per l'osso (BALP), la fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP), la superossido dismutasi (SOD), la malonaldeide (MDA), l'acetilcolinesterasi (AChE) e la colina acetiltransferasi (ChAT) sono stati acquistati da Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Il fissativo tissutale universale è stato ottenuto daChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Cina).
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2.3. Modelli e trattamenti animali
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati autorizzati e supervisionati dal Comitato etico animale della China Pharmaceutical University. I ratti sono stati mantenuti con un ciclo luce/buio di 12 ore in una stanza a temperatura controllata (22±2°C) e alimentati con foraggio e acqua di rubinetto pellettati standard.
Dopo l'adattamento di una settimana, il modello di osteoporosi è stato raggiunto conducendo un intervento chirurgico di ovariectomia (French et al., 2008). Al termine dell'operazione, la penicillina G sodica è stata cosparsa sulla sutura della ferita per una volta per prevenire l'infezione. I ratti sono stati poi nutriti normalmente per tre settimane. Secondo il riferimento (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), il modello diMorbo di Alzheimerpotrebbe essere indotto dall'iniezione intraperitoneale a lungo termine di D-galattosio in combinazione con ovariectomia o somministrazione intragastrica a lungo termine di AlCl3. Per studiare la fattibilità del modello di osteoporosi combinato con la malattia di Alzheimer, in questo studio sono stati impostati tre gruppi modello di ovariectomia (gruppo OVX), chirurgia fittizia con iniezione intraperitoneale di 150 mg/kg/d D-galattosio e somministrazione intragastrica di 30 mg/kg/d AlCl3 (gruppo D), ovariectomia con iniezione intraperitoneale di 150 mg/kg/d D-galattosio e somministrazione intragastrica di 30 mg/kg/d AlCl3 (gruppo OVX+D).
Pertanto, i ratti sono stati divisi in modo casuale in otto gruppi (n = 9 per ciascun gruppo) dopo 3 settimane e trattati per via orale con farmaci per 8 settimane: gruppo Sham; Gruppo OVX; Gruppo D; Gruppo OVX+D; gruppo di trattamento con estradiolo valerato (gruppo EV, OVX + D + 0,6 mg / kg / d estradiolo valerato); gruppo di trattamento con donepezil HCl (gruppo DPZ, OVX+D+0,8 mg/kg/d donepezil HCl);echinacosidegruppo di trattamento (gruppo ECH, OVX+D+90 mg/kg/d echinacoside);acteosidegruppo di trattamento (gruppo ACT, OVX+D+90 mg/kg/d acteoside). Secondo il principio di conversione della dose equivalente uomo-ratto e la dose da riferimento correlato (Li et al., 2013; Gao et al., 2014), sono stati adottati i dosaggi dei gruppi di trattamento farmacologico in questo studio.
Il peso corporeo di ciascun ratto è stato misurato ogni settimana. Dopo l'intero trattamento con farmaci della durata di 8 settimane, è stato eseguito per la prima volta il test Morris Water Maze (MWM) per 6 giorni. Successivamente, 6 ratti di ogni gruppo sono stati sacrificati per raccogliere i materiali. I ratti sono stati anestetizzati con iniezione intraperitoneale di 3,0 ml / kg di idrato di cloralio al 10% e il sangue è stato raccolto dagli addominali dell'aorta. Il sangue è stato posto a temperatura ambiente per coagulare e centrifugato a 3500 r / min per 10 minuti. Il siero è stato raccolto in un tubo di centrifuga da 1,5 ml (NEST Biotechnology) e conservato a -80 °C fino a quando non è stato utilizzato per test biochimici. Sono stati quindi raccolti gli uteri, i femori, le tibie e i tessuti cerebrali. Gli uteri erano usati per l'istomorfometria. I femori giusti sono stati utilizzati rispettivamente per la Micro-TC e l'istomorfometria. Le tibie giuste sono state utilizzate per il test biomeccanico. L'ippocampo raccolto sulla ghiacciaia è stato utilizzato per test biochimici. Successivamente, gli altri tre ratti di ciascun gruppo sono stati perfusi dal cuore con fissativo salino e tessuto universale per raccogliere il cervello per l'istomorfometria.
2.4. Prova morris Water Maze (MWM)
I ratti sono stati sottoposti all'apprendimento di riferimento spaziale e al test della memoria nel test MWM dopo 8 settimane di intervento. Il test MWM è stato eseguito seguendo i metodi riportati in precedenza (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Brevemente, 5 giorni consecutivi con quattro prove al giorno, i ratti sono stati addestrati a utilizzare una varietà di segnali visivi situati sulla parete della piscina per trovare una piattaforma sommersa nascosta (diametro 11 cm, altezza 29 cm) in una piscina circolare (diametro 130 cm, altezza 50 cm) piena di acqua colorata di inchiostro di carbonio non tossico. La piscina era immaginabilmente divisa in quattro quadranti e quattro posizioni di partenza si trovavano alle intersezioni dei quadranti. La piattaforma era situata al centro di uno dei quadranti e la posizione era costante durante le prove. In ogni prova, i ratti sono stati posizionati in modo casuale in posizioni selezionate, rivolti verso il muro della piscina. Ogni prova è stata terminata quando il ratto ha raggiunto la piattaforma o dopo 60 s, e il tempo trascorso è stato registrato come latenza di fuga. I ratti che non riuscivano a raggiungere la piattaforma sono stati guidati su di essa. Dopo ogni prova di piattaforma nascosta, il topo è rimasto sulla piattaforma per 10 s. Il tempo medio di latenza di quattro prove al giorno è stato calcolato come risultati dell'allenamento. Il giorno 6, tutti i ratti sono stati sottoposti a una prova di sonda in cui hanno nuotato per 60 s nella piscina senza piattaforma. I tempi di attraversamento nella posizione della piattaforma e il tempo di percorrenza nel quadrante target sono stati registrati come risultati finali. I ratti sono stati monitorati da una telecamera montata nel soffitto direttamente sopra la piscina e tutte le prove sono state registrate e analizzate utilizzando il programma MORRIS MAZE fornito da Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Pechino, Cina)
2.5. Test biochimico dell'ELISA
Secondo le istruzioni del produttore dei kit ELISA, l'attività della fosfatasi alcalina specifica per l'osso (BALP), l'attività della fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP), l'attività della superossido dismutasi (SOD) e il contenuto di malondialdeide (MDA) nel siero sono stati testati dal lettore di micropiastre multimodale BioTek Synergy 2 (BioTek, USA). I tessuti dell'ippocampo di ciascun gruppo sono stati lavati con PBS (0,01 M, pH 7,4) per rimuovere il sangue o le impurità rimanenti sulla superficie del tessuto. I tessuti dell'ippocampo su un lato sono stati pesati e poi tagliati a pezzi il più piccoli possibile. I tessuti dell'ippocampo sono stati omogeneizzati secondo il rapporto di 1: 9 (peso del tessuto: volume PBS). L'omogeneizzato è stato centrifugato a 4°C, 3000 r/min per 15 min. Il surnatante è stato raccolto e diluito per misurare la concentrazione proteica con il metodo BCA. L'attività dell'acetilcolinesterasi (AChE), l'attività della colina acetiltransferasi (ChAT), l'attività della superossido dismutasi (SOD) e il contenuto di malondialdeide (MDA) nel tessuto dell'ippocampo sono stati quindi testati con metodi ELISA.
2.6. Istomorfometria dell'ippocampo
I tessuti cerebrali (n = 3 / gruppo) sono stati fissati in fissativo tissutale universale. I campioni di tessuto cerebrale sono stati poi lavati, disidratati con etanolo sfumato, incorporati con cera di paraffina e tagliati in sezioni coronali di 5 μm. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (HE). Successivamente, le sezioni coronali dei tessuti cerebrali sono state fotografate da un microscopio a fluorescenza invertita (Nikon, Giappone). I cambiamenti morfologici di CA1, CA2, CA3 e DG nell'ippocampo sono stati osservati in particolare.
2.7. Istomorfometria uterina e morfometria
Gli uteri selezionati (n=3/gruppo) sono stati fissati in fissativo tissutale universale. I campioni di tessuto uterino sono stati poi lavati, disidratati con etanolo sfumato, incorporati con cera di paraffina e affettati in sezioni trasversali di 5 μm. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (HE). Le sezioni trasversali degli uteri sono state osservate e fotografate. Cinque campi visivi sono stati selezionati in modo casuale, il diametro della sezione trasversale uterina e lo spessore dell'epitelio della mucosa uterina sono stati quindi misurati utilizzando il software Image-Pro Plus 6.0. Sono stati contati anche i numeri delle ghiandole uterine nella lamina propria.
2.8. Micro-CT
Il femore destro selezionato (n = 3 / gruppo) è stato scansionato in una posizione con la distanza dell'oggetto dalla sorgente di 121 mm e la distanza della fotocamera alla sorgente di 171 mm utilizzando una tomografia computerizzata a micro raggi X SkyScan 1176 (Micro-CT) scanner (Bruker, Germania). La piastra di crescita distale è stata selezionata come superficie di riferimento. Con una distanza di 1 mm sotto la superficie di riferimento, è stata selezionata una regione di 1,8 mm di spessore come volume di interesse (VOI, 100 strati). Le immagini in scala di grigi risultanti avevano una dimensione in pixel di 17,76 μm dalla ricostruzione ossea (65 kV, 385 μA). Un metodo di contornatura semi-automatico è stato impiegato per selezionare le trabecole dall'osso corticale. Sono stati utilizzati metodi di misurazione 3D diretta per valutare la percentuale del volume osseo (BV/TV), la densità della superficie ossea (BS/TV), la separazione trabecolare (Tb. Sp), il numero trabecolare (Tb. N), lo spessore trabecolare (Tb. Th), l'indice del modello di struttura (SMI), il fattore di pattern trabecolare (Tb. Pd) e la densità minerale ossea media (BMD media) per lo stesso VOI utilizzando ilCTProgramma di analisi (Bruker, Germania). La visualizzazione 3D del VOI utilizzando un algoritmo di rendering adattivo è stata effettuata con il software CTvol (Bruker, Germania).
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2.9. Istomorfometria ossea
Il femore destro selezionato (n=3/gruppo) è stato fissato in fissativo tissutale universale e poi decalcificato in una soluzione di EDTA-2Na al 10% per 3 settimane. I campioni decalcificati sono stati lavati, disidratati con etanolo sfumato, incorporati con cera di paraffina e affettati in sezioni longitudinali di 5 μm. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (HE). Le sezioni longitudinali del femore sono state fotografate. Sono state osservate le strutture del tessuto osseo di ciascun gruppo, in particolare le strutture ossee trabecolari.
2.10. Prova biomeccanica
Le tibie giuste (n = 4 / gruppo) selezionate casualmente sono state valutate per il test di flessione a tre punti utilizzando una macchina di prova universale (SHIMADZU, Giappone). I diametri di questi campioni sono stati misurati con pinza vernier nell'intervallo 2,16-2,38 mm (d). Il campione è stato quindi posizionato su due traverse di supporto con una distanza di 25 mm (L) tra le due rotaie e la curvatura fisiologica del campione era verso l'alto. L'asta di carico del carico si trovava al centro del campione e cadeva a una velocità costante di 1,5 mm / min fino a quando il campione non si rompeva. I dati di forza (F) e di spostamento sono stati automaticamente registrati in un computer che è stato interfacciato alla macchina di prova e la curva di deformazione del carico è stata tracciata contemporaneamente. I valori di carico massimo (N) e assorbimento di energia (mJ) sono stati registrati contemporaneamente dal software di test dei materiali TRAPEZIUM X. I valori di sollecitazione massima (MPa) sono stati calcolati secondo la seguente formula: Stress (σ) = momento flettente (M) / Fattore di sezione (Z) = (8×L×F) / (π×d3 )
2.11. Analisi statistica
I risultati dei gruppi modello sono stati confrontati con il gruppo Sham e quelli dei gruppi trattati con farmaci sono stati confrontati con il gruppo OVX + D. I dati sono stati analizzati utilizzando ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Bonferroni utilizzando il software Graph Pad Prism 5.0. I dati sono stati espressi come ± SD e valori P inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
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