ParteⅠComprensione metabolica della disregolazione genetica nel microambiente tumorale del carcinoma renale renale a cellule chiare

Astratto

La disregolazione metabolica è un segno distintivo dei tumori, incluso il KIRC, specificamente causato da alterazioni nei geni metabolici. Attualmente, esiste una mancanza di consenso tra le firme metaboliche nel microambiente tumorale. In questo studio, abbiamo osservato le correlazioni significative dei geni metabolici differenzialmente espressi (DEmG) tra KIRC e i relativi campioni normali. In breve, abbiamo raccolto serie di geni metabolici attraverso dati RNA-seq di KIRC e tessuti normali da TCGA, seguiti dall'identificazione di DEmG correlati a KIRC. Successivamente, i pazienti sono stati classificati in tre cluster e, utilizzando WGCNA, abbiamo identificato i geni metabolici coinvolti nella sopravvivenza tra diversi cluster.

Inoltre, abbiamo studiato la sopravvivenza e i parametri clinici insieme all'infiltrazione immunitaria nei cluster. Allo stesso tempo, abbiamo costruito e convalidato un modello di previsione basato su questi DEmG. Queste analisi hanno rivelato che i pazienti con un'elevata espressione di DEmG mostravano una scarsa sopravvivenza, mentre l'infiltrazione di cellule meno immunitarie era associata alla metastasi di KIRC. Alla fine, abbiamo identificato NUDT1 come un gene hub poiché mostrava un'espressione significativamente elevata nei campioni KIRC, nonché associato alla sopravvivenza e alla prognosi dei pazienti. Ulteriori analisi hanno rivelato il ruolo oncogenico di NUDT1 nelle cellule 786-O e ACHN. Pertanto, concludiamo che NUDT1 potrebbe essere un potenziale marker diagnostico e prognostico per KIRC.

Parole chiave

Disregolazione metabolica; Geni metabolici differenzialmente espressi (DEmG); Tasso di sopravvivenza; NUDT1;Benefici Cistanche.

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introduzione

Il carcinoma renale a cellule chiare (KIRC) è un tipo di carcinoma a cellule renali (RCC), considerato uno dei tumori comuni che rappresenta il 70-80% dei casi [1], classificato come la 16a causa più comune di mortalità correlata al cancro mondiale [2]. Il carcinoma a cellule renali (RCC) è il tipo più comune di cancro renale e rappresenta il 90% dei casi di cancro del rene [3]. Recentemente, l'identificazione basata sulla bioinformatica dei potenziali marcatori nei tumori è ampiamente utilizzata, ma sono stati identificati solo pochi biomarcatori affidabili di KIRC o la maggior parte dei marcatori finora non è stata completamente convalidata. Pertanto, le analisi bioinformatiche abbinate alle convalide sperimentali sono necessarie per chiarire il potenziale meccanismo della biogenesi e della progressione del KIRC [4]. La profonda esplorazione del microambiente tumorale e lo sviluppo dell'immunoterapia hanno permesso di studiare l'interazione tra tumori e sistema immunitario [5]. Tuttavia, molti dei biomarcatori identificati non sono stati studiati per il loro effetto sul fenotipo cellulare e sui rispettivi meccanismi molecolari sottostanti nel KIRC [6]. Tuttavia, la prognosi dei pazienti con KIRC è poco conosciuta e la sopravvivenza complessiva di 5-anni è inferiore al 10% dopo la prima diagnosi [7, 8]. Generalmente, i tessuti normali contengono prevalentemente alti livelli di fattori antiangiogenici. Il disturbo nel livello di questi fattori può attivare i fattori proangiogenici che aumentano ulteriormente la divisione delle cellule a un tasso anormale che porta alla formazione del tumore [9]. In questo processo, le cellule tumorali esprimono un alto livello di fattore di crescita proangiogenico e questo effetto supporta lo sviluppo di nuovi vasi sanguigni nei tumori [10]; quindi, inizia lo sviluppo del tumore. Quindi, molti altri fattori sono coinvolti nella tumorigenesi, inclusa l'infiltrazione delle cellule immunitarie e l'espressione di vari geni metabolici. È noto che la presenza di diversi tipi di cellule immunitarie nel microambiente tumorale influisce in gran parte sulla progressione del tumore e sull'immunoterapia; pertanto, le alterazioni dei geni immuno-correlati influenzano anche la proporzione e la funzione delle cellule immunitarie nel microambiente tumorale [11]. Ad esempio, l'infiltrazione di cellule immunitarie nel microambiente tumorale influisce in modo significativo sullo sviluppo del glioma [12]. Nonostante lo scarso interesse per i geni metabolici che influenzano i tumori, gli studi attuali hanno rinnovato la consapevolezza del cancro come disturbo metabolico [13, 14]. Questi studi forniscono la base per includere la riprogrammazione metabolica come nuovo segno distintivo della trasformazione maligna [15]. Tuttavia, l'espressione di tutti i geni o percorsi metabolici tra diversi tessuti, inclusi tumori e tessuti normali, differisce l'una dall'altra ed è in gran parte inesplorata, specialmente nel KIRC.

Nel complesso, esiste un numero inferiore di biomarcatori affidabili disponibili per la previsione della prognosi e delle risposte immunoterapeutiche nel KIRC; quindi, è difficile avere un completo successo clinico. Pertanto, studi bioinformatici completi associati a convalide sperimentali potrebbero chiarire i potenziali meccanismi della biogenesi e della progressione del KIRC. Pertanto, l'attuale studio ha lo scopo di valutare in modo completo gli effetti delle vie metaboliche sui profili trascrizionali metabolici in KIRC rispetto ai loro tessuti normali abbinati. Qui, non solo abbiamo segregato con successo i diversi siti della malattia o i diversi sottotipi molecolari della stessa malattia, ma abbiamo anche previsto la risposta alla terapia mirata al metabolismo. Questo rappresenta un nuovo modo di identificare un meccanismo mediante il quale le vie metaboliche sono disturbate nella neoplasia e offre nuovi bersagli per gli interventi clinici.

Cistanche standardizzate

Materiale e metodi

1. Acquisizioni dati.

I dati di sequenziamento dell'RNA (FPKM) relativi a KIRC sono stati scaricati direttamente da The Cancer Genome Atlas (TCGA). Successivamente, i dati sono stati elaborati in base alle applicazioni a valle desiderate. Inoltre, i dati clinicopatologici per i corrispondenti pazienti KIRC, tra cui sesso, razza, età, posizione del tumore, classificazione istologica, grado di differenziazione, stadio del tumore e informazioni sulla sopravvivenza, sono stati ottenuti da UCSC Cancer Browser. Per ottenere informazioni sull'eterogeneità metabolica dei pazienti KIRC, i set di geni metabolici sono stati presi da pubblicazioni precedenti [16, 17]. L'abstract grafico di questo studio è mostrato nella Figura 1 supplementare e il flusso di lavoro dettagliato dell'acquisizione dei dati e dello studio del processo a valle è mostrato nella Figura 2 supplementare.

2. Identificazione dei geni metabolici differenzialmente espressi (DEmG).

I set di geni metabolici sono stati identificati dall'intersezione di due set di dati e utilizzati per l'analisi DEG tra campioni tumorali e normali. Successivamente, abbiamo anche identificato i DEmG utilizzando WGCNA e, in base alle modalità di sopravvivenza, i pazienti li hanno classificati in tre cluster. In breve, i pazienti sono stati divisi in tre cluster, vale a dire cluster C1, cluster C2 e cluster C3. Per identificare i DEG, sono stati utilizzati modelli lineari utilizzando il pacchetto R limma. Un valore p aggiustato per il tasso di scoperta falso (FDR) < 0.05 combinato con un valore assoluto simultaneo di cambiamento di piega log2, logFC> 1 e logFC <-1 sono stati impostati come soglia per l'identificazione DEG. I grafici del vulcano sono stati realizzati utilizzando ggplot2. I geni con logFC> 1 sono stati considerati sovraregolati e quelli con logFC <−1 sono stati assegnati come geni sottoregolati.

3. Analisi di arricchimento funzionale e interazione proteina-proteina.

Le analisi di arricchimento dei termini GO e KEGG sono state eseguite attraverso il profilo del cluster del pacchetto R. I termini GO sono stati divisi in tre categorie tra cui funzioni molecolari (MF), componenti cellulari (CC) e processi biologici (BP). Per determinare le differenze e le correlazioni significative dei DEmG tra tumore e tessuti normali, abbiamo utilizzato il software computazionale GSEA (analisi dell'arricchimento del set genico). Sono state eseguite analisi di arricchimento KEGG e GO (Gene Ontology) dei DEG per identificare potenziali percorsi e funzioni. Inoltre, l'applicazione del cistoscopio è stata utilizzata per costruire la rete di interazione proteina-proteina (PPI) di DEmG. Il PPI iniziale è stato ottenuto dal database STRING. Il limite di confidenza più alto è stato impostato su 0.9.

4. Analisi di sopravvivenza.

I geni differenzialmente espressi nei pazienti con carcinoma renale sono stati identificati attraverso il pacchetto limma e i geni differenzialmente espressi sono stati analizzati utilizzando il pacchetto WGCNA per eseguire la coespressione, per costruire una rete di coespressione che ha identificato un totale di 6 moduli.=5 e la rete è una rete senza scala. Il significato prognostico dei DEmG identificati da WGCNA in modalità di sopravvivenza è stato determinato dai grafici di Kaplan-Meier (KM) con il log-rank test.

Pillole di cistanche

5. Analisi dell'infiltrazione immunitaria.

Le cellule immunitarie e stromali sono state calcolate utilizzando il pacchetto R, "xCELL; " i campioni con p < 0:05 sono stati selezionati per ulteriori analisi. Inoltre, le cellule immunitarie contenenti marcatori biologici sono state analizzate dal pacchetto R GSVA. Inoltre, per analizzare la purezza del tumore, abbiamo utilizzato l'algoritmo ESTIMATE per stimare i punteggi stromali e immunitari di una serie di tessuti KIRC.

6. Costruzione del modello di previsione.

I geni metabolici differenzialmente espressi sono stati ottenuti dai dati di sequenziamento dell'RNA dei tumori KIRC con informazioni sulla sopravvivenza e i pazienti sono stati divisi casualmente in coorti di addestramento e test utilizzando il pacchetto R "caret"; quindi, è stata eseguita un'analisi di sopravvivenza univariata sui DEmG. Inoltre, l'analisi LASSO è stata eseguita dal pacchetto R "glmnet;" e per l'ottimizzazione del modello di previsione, è stato utilizzato un modello di rischio proporzionale graduale.

7. Coltura cellulare.

Le linee cellulari di carcinoma renale umano 786-O e ACHN sono state acquistate dall'American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA). Le linee cellulari 786-O sono state coltivate in terreno RPMI 1640 (cat. n. 11875093, Invitrogen, Carlsbad, CA, Stati Uniti) integrato con il 10% di siero bovino fetale (cat. n. 04-001- 1ACS, industrie biologiche, Israele). Le linee cellulari ACHN sono state coltivate in terreno MEM (cat. N. 41500034, Invitrogen, Carlsbad, CA, Stati Uniti) integrato con il 10% di siero bovino fetale. Tutte le colture sono state incubate a 37 gradi C e 5% di CO2₂in un incubatore umidificato.

8. PCR quantitativa in tempo reale.

L'RNA totale dalle linee cellulari e dai tessuti KIRC è stato isolato utilizzando TRIzol (cat. N. 9109; TaKaRa, Tokyo, Giappone) secondo i protocolli del produttore. RT-qPCR è stata eseguita utilizzando il kit QuantiNova SYBR Green PCR (cat. N. 208054, QIAGEN, Duesseldorf, Germania). L'espressione genica relativa è stata calcolata dal 2^−ΔΔctmetodo. Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella supplementare 1.

9. Saggio di vitalità cellulare.

La citotossicità dopo la trasfezione del siRNA NUDT1 in 786-O e ACHN è stata determinata utilizzando un kit per il conteggio delle cellule-8 (CCK-8) (cat. n. C0038, Beyotime Biotechnology Co. Ltd., Cina). Le sequenze di siRNA NUDT1 sono fornite nella Tabella 1 supplementare. Sono state sintetizzate da GenePharma (Shanghai, Cina). In breve, entrambe le linee cellulari 786-O e ACHN nella fase di crescita logaritmica (24 ore dopo la trasfezione di siRNA) sono state raccolte e distribuite in 96-pozzetti di coltura cellulare (1000 cellule/pozzetto). Il giorno seguente, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 10 ul di CCK-8. Dopo l'incubazione a 37 gradi C per altre 2 ore, la densità ottica (OD) a 450 nm di cellule è stata rilevata tramite un lettore di micropiastre (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA).

10. Saggio di migrazione cellulare, invasione e apoptosi.

Le cellule KIRC {{0}}O e ACHN sono state trasfettate per il knockdown mediato da siRNA di NUDT1. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state seminate nelle 6-pozzetti per il saggio di guarigione della ferita. Dopo che le cellule hanno ottenuto una confluenza del 100%, le ferite sono state generate nelle cellule come un monostrato utilizzando una punta di pipetta di plastica. Le cellule sono state quindi lavate con PBS e coltivate per altre 48 ore. La distanza di chiusura della ferita è stata visualizzata al microscopio e fotografata per misurare l'effetto del knockdown di NUDT1 sulle cellule KIRC 786-O e ACHN. La migrazione e l'invasione cellulare sono state eseguite utilizzando piastre transwell 24-well (Corning, New York, NY). In breve, un numero uguale di cellule è stato coltivato nel terreno privo di FBS nella camera superiore e la migrazione delle cellule è stata osservata nella camera inferiore del transwell dove il terreno è stato integrato con il 10% di FBS. Le camere Transwell sono state accuratamente lavate e colorate con cristalvioletto allo 0,2%, visualizzate e fotografate; in seguito, le differenze tra le cellule migrate tra il controllo negativo e il knockdown NUDT1 sono state determinate semplicemente dal conteggio delle cellule. Il test dell'apoptosi è stato eseguito dopo 72 ore dalla trasfezione, le cellule sono state raccolte, lavate e risospese in PBS ghiacciato. Le cellule sono state quindi rilevate dal kit di rilevamento dell'apoptosi (cat. N. KGA1013, KeyGen BioTech, Nanjing, Cina) secondo le istruzioni del produttore ed esaminate mediante citometria a flusso (FACScan; BD Biosciences). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.

11. Analisi statistica.

Tutte le analisi statistiche sono state eseguite al prisma GraphPad (V7.0) e R (3.6.4), il test Wilcox è stato utilizzato per confrontare l'infiltrazione di cellule immunitarie nei tessuti normali e tumorali e il test chi-quadrato è stato eseguito per studiare la correlazione tra infiltrazione di cellule immunitarie e parametri patologici. L'analisi della varianza è stata utilizzata per confrontare il punteggio immunitario, il punteggio stromale e la purezza del tumore tra i tre cluster. Per l'analisi della sopravvivenza, il valore p è stato calcolato utilizzando il log-rank test. Un valore p di<0.05 was considered statistically significant.

Integratori di cistanche

Riferimenti

[1] V. Nerich, M. Hugues, T. Nai, et al., "Impatto clinico delle terapie mirate nei pazienti con carcinoma a cellule renali a cellule chiare metastatico", Oncotargets and Therapy. vol. 7, pp. 365–374, 2014.

[2] A. Znaor, J. Lortet-Tieulent, M. Laversanne, A. Jemal e F. Bray, "Variazioni e tendenze internazionali nell'incidenza e nella mortalità del carcinoma a cellule renali", European Urology, vol. 67, n. 3, pp. 519–530, 2015.

[3] B. Ljungberg, L. Albiges, Y. Abu-Ghanem, et al., "European Association of Urology Guidelines on Renal Cell Carcinoma: The 2019 Update", European Urology, vol. 75, n. 5, pp. 799–810, 2019.

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[6] W. du, L. Zhang, A. Brett-Morris et al., "HIF guida la deposizione lipidica e il cancro nel ccRCC attraverso la repressione del metabolismo degli acidi grassi", Nature Communications, vol. 8, n. 1, pag. 1769, 2017.

[7] A. Jemal, R. Siegel, E. Ward, et al., "Cancer statistics, 2008," CA: A Cancer Journal for Clinicians, vol. 58, n. 2, pp. 71–96, 2008.

[8] I. Lucca, T. Klatte, H. Fajkovic, M. de Martino e SF Shariat, "Erratum: differenze di genere nell'incidenza e negli esiti del cancro uroteliale e del rene", Nature Reviews Urology, vol. 12, n. 12, pag. 653, 2015.

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[10] C. Kut, F. Mac Gabhann e AS Popel, "Dov'è il VEGF nel corpo? Una meta-analisi della distribuzione del VEGF nel cancro", British Journal of Cancer, vol. 97, n. 7, pp. 978–985, 2007.

[11] F. Ren, Q. Zhao, M. Zhao, et al., "Profilo dell'infiltrazione immunitaria nel cancro gastrico e loro implicazioni cliniche", Cancer Science, vol. 112, n. 9, pp. 3569–3584, 2021.

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[14] DS Wishart, "Il cancro è una malattia genetica o una malattia metabolica?" biomedicina, vol. 2, n. 6, pp. 478-479, 2015.

[15] D. Hanahan e RA Weinberg, "Caratteristiche del cancro: la prossima generazione", Cell, vol. 144, n. 5, pp. 646–674, 2011.

[16] X. Peng, Z. Chen, F. Farshidfar, et al., "Caratterizzazione molecolare e rilevanza clinica dei sottotipi di espressione metabolica nei tumori umani", Cell Reports, vol. 23, n. 1, pp. 255–269.e4, 2018.

[17] S. Haider, A. McIntyre, RG van Stiphout, et al., "Le alterazioni genomiche sono alla base di uno spostamento metabolico pan-cancro associato all'ipossia tumorale", Genome Biology, vol. 17, n. 1, pag. 140, 2016.

Junwei Xie, 1,2,3,4,5 Lingang Cui, 6 Shaokang Pan, 1,2,3,4,5 Dongwei Liu, 1,2,3,4,5 Fengxun Liu, 1,2,3,4 ,5 e Zhangsuo Liu 1,2,3,4,5

1 Dipartimento di Nefrologia, Il primo ospedale affiliato dell'Università di Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Cina

2 Istituto di ricerca di nefrologia, Università di Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Cina

3 Centro di ricerca per le malattie renali, Zhengzhou, 450052 Henan, Cina

4 Key Laboratory of Precision Diagnosis and Treatment for Chronic Kidney Disease in Henan Province, Zhengzhou 450052, Cina

5 Unità centrale del Centro nazionale di ricerca medica clinica sulle malattie renali, Zhengzhou 450052, Cina

6 Dipartimento di Urologia, Il primo ospedale affiliato dell'Università di Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Cina