PARTE Ⅱ: L'infezione da SARS-CoV-2 nel modello del criceto siriano provoca infiammazione e disregolazione dell'interferone di tipo I nei tessuti sia respiratori che non, inclusi cuore e reni

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Magen Ellen Francis, Una Goncin & et al.

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COVID-19(malattia da coronavirus 2019) causata daSARS-CoV-2(Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2) l'infezione è una malattia che colpisce diversi sistemi di organi. Un modello che cattura tutti i sintomi clinici diCOVID-19, così come la malattia da lungo raggio, è necessaria. Abbiamo studiato le risposte dell'ospite associate all'infezione in diversi importanti sistemi di organi tra cui il tratto respiratorio, il cuore e ilrenidopoSARS-CoV-2infezione nei criceti siriani. Abbiamo riscontrato aumenti significativi delle citochine infiammatorie (IL-6, IL{1}}beta e TNF) e degli interferoni di tipo II mentre gli interferoni di tipo I erano inibiti. L'esame del tessuto extrapolmonare ha indicato un'infiammazione nelrene, fegato e cuore che mancavano anche di sovraregolazione dell'interferone di tipo I. Istologicamente, il cuore presentava evidenza di miocardite e microtrombi mentre ilreneaveva un'infiammazione tubulare. Questi risultati forniscono informazioni sulla malattia multiorgano vissuta dalle persone conCOVID-19e forse la malattia prolungata nelle persone con sequele post-acute diSARS-CoV-2(PASC). coronavirus 2) l'infezione può colpire diversi sistemi di organi tra cui il tratto respiratorio, il tratto urinario, il sistema neurologico e il sistema cardiovascolare. Per studiare in modo appropriato questa malattia e valutare le terapie, un modello che cattura tutti i sintomi clinici diCOVID-19è obbligatorio. È noto che il danno che si verifica dopo l'infezione virale è spesso dovuto alle risposte immunitarie dell'ospite. Pertanto, qui abbiamo studiato come le risposte dell'ospite immunitario sono regolate in diversi importanti sistemi di organi tra cui il tratto respiratorio, il cuore e ilrenidopoSARS-CoV-2infezione nei criceti siriani. Abbiamo riscontrato aumenti significativi delle citochine infiammatorie (IL-6, IL{1}}beta e TNF), nonché delle citochine antivirali, chiamate interferoni di tipo I. È interessante notare che gli interferoni di tipo I della risposta antivirale sono stati inibiti nel tratto respiratorio. L'esame del tessuto extrapolmonare ha indicato un'infiammazione nelrene, fegato e cuore che mancavano anche di sovraregolazione dell'interferone di tipo I. Istologicamente, il cuore presentava evidenza di miocardite e microtrombi mentre ilreneaveva un'infiammazione tubulare. Questi risultati forniscono informazioni sulla malattia multiorgano vissuta dalle persone conCOVID-19e forse la malattia prolungata nelle persone con sequele post-acute diSARS-CoV-2(PASC).

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L'infezione da SARS-CoV-2 provoca un'infiammazione significativa o una regolazione immunitaria nel cuore, nei linfonodi e nella milza, nonché nelle firme degli eosinofili nell'intestino crasso

I marcatori immunitari di infiammazione, immunità adattativa e risposte antivirali sono stati valutati anche nei tessuti non respiratori insieme all'istopatologia dei tessuti. Abbiamo studiato il linfonodo mediastinico, il cuore,rene, milza, fegato e intestino crasso per la regolazione dei bersagli immunitari classificati come sopra per IFN di tipo I, tipo II/Risposta generale all'IFN e Mediatori innati/adattativi (Fig. 6), nonché per l'immunopatologia (Figg. 7 e S4). Se la valutazione iniziale dell'istopatologia suggeriva il coinvolgimento di meccanismi immunitari specifici (Fig. S4), è stata eseguita una scansione ad alta risoluzione per acquisire una maggiore profondità di informazioni (Fig. 7). I linfonodi mediastinici non sono stati in grado di essere recuperati il ​​giorno 15. I significati corrispondenti per l'espressione genica possono essere trovati nella tabella S2. Le risposte IFN di tipo I e di tipo II in tutti gli organi extrapolmonari eccetto il fegato avevano profili di regolazione simili a quelli dei polmoni e dei turbinati nasali (Fig. 6). La regolazione genica era caratterizzata da una diminuzione delle risposte di tipo I e da un aumento delle risposte di tipo II. STAT2 era significativamente diminuito nel linfonodo mediastinico,rene, milza e intestino crasso. Il cuore ha avuto diminuzioni significative e sostenute di IRF1 mentre l'intestino crasso ha avuto diminuzioni di IFN-beta (Fig. 6). Al contrario, marcati aumenti di IFN-gamma sono stati osservati nel linfonodo mediastinico erenee in misura minore nel cuore e nella milza. CXCL10, il chemiotattico delle cellule T, è stato aumentato a livelli elevati nella milza, nel fegato e nel linfonodo mediastinico dove la regolazione era bifasica nel linfonodo (Fig. 6). La regolazione dei geni mediatori innati/adattativi nella milza e nei linfonodi è stata osservata per tutti i bersagli immunitari esaminati ad eccezione di TGF-beta, IL-5R e CCR3 che non erano regolati in modo efficace. In particolare, la regolamentazione significativa di CD3, CD4, CD8A, IL-2, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL{13 }} e IL-12 è stato notato in questi organi immunitari secondari. La regolazione dei mediatori immunitari innati/adattativi è stata particolarmente interessante nel cuore dove IL-2, IL-10, IL-4 e IL{18}} sono aumentati di 100 volte rispetto al basale . La più alta sovraregolazione delle citochine infiammatorie è stata rilevata nel cuore, seguita dal rene, dal fegato e dal linfonodo mediastinico. Nel cuore, IL-12 è aumentato significativamente all'inizio e, insieme al TNF, è rimasto elevato al giorno 15 pi. Anche IL-6 e IL{23}}beta sono stati indotti transitoriamente nel tessuto cardiaco nei giorni 5 e 8 (Fig. 6). Cambiamenti significativi nel cuore sono stati osservati dall'analisi istologica (S4 Fig). L'imaging ad alta risoluzione ha trovato prove di microtrombi (Fig. 7A, frecce bianche) e miocardite (Fig. 7B, frecce bianche) nel cuore. CD14, IL{32}}beta e TNF sono stati sovraregolati all'inizio del rene ma sono diminuiti dal giorno 8 a 12 pi (Fig. 6) che ha coinciso con l'infiltrazione di cellule infiammatorie nel rene e possibilmente danno renale acuto o danno tubulare (indicato dalle frecce bianche, Fig 7C). L'espressione di IL-6 è stata mantenuta nel fegato, dove anche IL{38}}beta è stato aumentato negli orari tardivi. Il linfonodo mediastinico presentava un aumento bifasico di IL-12 con aumenti transitori di IL-6 e TNF a livelli di piega rispettivamente di 12, 8 e 11. L'intestino crasso aveva una regolazione significativa di IL-5, IL{45}}R e CCR3 con infiltrazione di eosinofili (Fig. 7D), ma una regolazione minima di qualsiasi altro mediatore innato/adattivo. Per accompagnare l'analisi degli organi extrapolmonari, abbiamo analizzato la chimica del sangue degli animali nel corso del tempo per valutare la disfunzione d'organo (Fig. S5). Abbiamo analizzato glucosio, albumina, fosfatasi alcalina, alanina transferasi, azoto ureico, bilirubina totale e proteine ​​totali come segni di funzionalità epatica[27]. Calcio, potassio, albumina, amilasi, azoto ureico nel sangue e proteine ​​totali sono stati analizzati per valutare il rene[27]. La salute gastrointestinale è stata valutata attraverso sodio, potassio e fosfatasi alcalina[27]. La funzione cardiaca è stata misurata utilizzando sodio, potassio e alanina transferasi[27]. La sovraregolazione della globulina è stata valutata come segno di stimolazione antigenica[27]. Delle 14 molecole studiate, solo l'amilasi e il glucosio erano significativamente aumentati negli animali infetti rispetto ai controlli, con un picco rispettivamente di 1700 U/L e 280 mg/dL il giorno 8 pi. Inoltre, le variazioni della concentrazione di potassio ([K più]) sono state le più notevoli e sembravano essere per lo più legate al tempo durante il periodo dello studio poiché la maggior parte degli individui ha avuto un aumento di [K più ] con il cambiamento più grande osservato al giorno 15. L'aumento anche nell'albumina era notevole ma lieve in molti animali. La concentrazione proteica totale è leggermente aumentata nella maggior parte dei soggetti, ma il cambiamento è relativamente lieve e probabilmente clinicamente insignificante. Altri marcatori epatici hanno raggiunto il picco più tardi nel corso del tempo, inclusi glucosio (280 mg/dl) al giorno 8, fosfatasi alcalina (ALP) al giorno 12 (3 U/l) e azoto ureico (BUN) (22 mg/dl) il giorno 15. L'alanina transferasi (ALT), sebbene abbia raggiunto il picco il giorno 2, era alta il giorno 12 a poco meno di 100 U/L, suggerendo un possibile danno epatico. Anche i marker renali hanno raggiunto il picco più tardi, il giorno 8 per l'amilasi (1700 U/L) e il giorno 15 per il potassio e BUN (rispettivamente 12 e 22 mg/dl). BUN con poche eccezioni ha avuto un possibile aumento della concentrazione dipendente dal tempo. Il calcio, al contrario, ha raggiunto il picco il giorno 2 a 2,6 mg/dl ma è rientrato nei range di riferimento. I marker di salute gastrointestinale e cardiaca come il sodio, hanno mostrato una regolazione minima, mentre [K plus ] è aumentato in modo relativamente lineare durante il decorso del tempo infettivo, con un picco al giorno 15 (12 mg/dl). L'ALP (marcatore gastrointestinale) era elevato nei giorni 5 e 8 a 3u/l e l'ALT (marcatore cardiaco) era aumentato nei criceti infetti rispetto ai criceti non infetti nei giorni 2, 8 e 12 a 75-100 U/l ma il le differenze non erano significative. Infine, la globulina ha raggiunto il picco il giorno 2 a 0,6 g/dL ed è diminuita in modo relativamente lineare nel corso del tempo. Nel loro insieme, l'analisi del sangue indica una disregolazione negli organi extrapolmonari, nonché una stimolazione antigenica in risposta aSARS-CoV-2.

Fig 6. L'infezione da SARS-Cov-2 nei criceti porta ad un aumento dei geni infiammatori e correlati ai mediatori immunitari in organi extrapolmonari selezionati, probabilmente indicando miocardite, evoluzione immunitaria adattativa e infiltrazione di eosinofili nell'intestino crasso.qRT-PCR è stata eseguita su RNA estratto da linfonodo mediastinico (M), cuore, rene, milza, fegato e intestino crasso daSARS-CoV-2criceti inoculati. I campioni sono stati valutati per la risposta all'interferone di tipo I correlata (IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), alla risposta all'interferone di tipo II (IFN-gamma, IRF2, STAT1, CXCL10) e innata/ mediatore adattivo (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-10, IL-4, IL{20}}, Geni IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1beta, IL-6, TNF) sfruttando i primer PCR specifici per le sequenze di criceti (Tabella 1). Il cambiamento di piega è stato calcolato tramite ΔΔCt rispetto al basale (giorno 0) con BACT come gene di mantenimento. N è 3 per tutti i punti temporali.

Discussione

OriginariamenteSARS-CoV-2si pensava che l'infezione causasse principalmente malattie respiratorie, ma ora è chiaro cheCOVID-19è una malattia multiforme che colpisce diversi apparati[25,26]. Per ottenere una migliore comprensione dell'origine della malattia e della miriade di sintomi clinici sperimentati nell'uomo, abbiamo studiato l'immunopatologia attraverso il tratto respiratorio e gli organi non respiratori duranteSARS-CoV-2infezione nei criceti siriani. Infezione con 105 TCID50 diSARS-CoV-2ha provocato una malattia clinica da lieve a moderata. Il virus infettivo era contenuto principalmente nel tratto respiratorio sebbene l'RNA virale fosse presente in tutti i tessuti valutati. Il profilo della risposta dell'ospite nel tratto respiratorio ha identificato l'inibizione della risposta dell'IFN di tipo I con un aumento concomitante di IFN di tipo II, citochine infiammatorie, citochine innate e adattative. L'indagine sugli organi extrapolmonari ha anche riscontrato un profilo simile per la segnalazione di IFN di tipo I e II; tuttavia, è stata anche identificata la regolazione immunitaria tessuto-specifica. Nello specifico, nel cuore e nella milza è stata identificata un'espressione significativa di mediatori innati e adattativi. Dal momento che il trattamento antivirale duranteSARS-CoV-2l'infezione è efficace solo durante una breve finestra[28], graveCOVID-19si pensa che sia una conseguenza di una risposta immunitaria disregolata[29]. La comprensione della patogenesi immunitaria è essenziale per identificare i bersagli terapeutici e il trattamento dei sintomi acuti non respiratori associatiCOVID-19comprese palpitazioni cardiache o emicrania e condizioni di lunga durata nella fase di recupero come le sequele post acute diSARS-CoV-2infezione (PASC), denominata anche long-COVID[30].

Fig 7. Alcuni organi extrapolmonari hanno una patologia distinta dopo l'infezione da SARS-CoV-2 con evidenza di microtrombi e miocardite nel cuore, danno tubulare nel rene e infiltrazione di eosinofili nell'intestino crasso.Il cuore, i reni e l'intestino crasso sono stati raccolti da ciascun animale durante l'autopsia e fissati in formalina al 10% prima dell'inclusione del blocco di paraffina. I tessuti sono stati colorati con H&E. I tessuti del cuore hanno mostrato microtrombi (frecce bianche) per più giorni (A), così come miocardite il giorno 8 (freccia bianca) (B). Il rene presentava una lesione acuta/tubolare (frecce bianche) (C). L'intestino crasso presentava infiltrazione di eosinofili (frecce bianche) (D). I tessuti macchiati sono stati visualizzati e sottoposti a imaging utilizzando lo scanner per vetrini Aperio ScanScope XT. Le immagini mostrate sono rappresentative di 3 animali per gruppo, per punto temporale.

Il sito principale di infezione che influenza la trasmissione perSARS-CoV-2nelle persone è il tratto respiratorio. Pertanto, l'obiettivo iniziale della nostra indagine era il tratto respiratorio, comprese le risposte immunitarie associate e l'immunopatologia. Qui abbiamo dimostrato l'infezione delle vie respiratorie superiori e inferiori e la malattia associata a seguito dell'infezione da SARS-CoV-2 nei criceti siriani. L'infezione virale nel polmone ha portato a una grave patologia caratterizzata dall'infiltrazione di cellule infiammatorie con conseguente broncopolmonite entro il giorno 5 pi ed emorragia entro il giorno 8. Questi risultati erano coerenti con l'infezione da SARS-CoV-2 in precedenti studi sui criceti siriani[19, 20,31,32] e modelli animali più grandi, inclusi i macachi rhesus[33], nonché una grave polmonite identificata in alcuni esseri umaniCOVID-19pazienti[34-36]. La coerenza dei dati supporta l'uso del criceto per modellareSARS-CoV-2infezione delle malattie respiratorie umane e l'immunopatologia associata. Abbiamo anche notato che alcuni criceti hanno subito una maggiore perdita di peso correlata a una maggiore carica virale. Il peso differenziale potrebbe essere dovuto all'istinto naturale dei criceti di nascondere il cibo all'interno delle loro guance, all'inoculazione inefficiente o all'esistenza di proprietà intrinseche dell'ospite che possono portare a una perdita di peso differenziale e alla replicazione virale in questo ceppo animale. Poiché tutti gli animali sono stati controllati per la conservazione del cibo in bocca e tutti gli animali sono risultati positivi per ilSARS-CoV-2virus, non riteniamo che questo risultato sia il riflesso di errori di pesatura o di scarsa inoculazione. È necessario più lavoro per determinare se ci sono differenze genetiche all'interno dei criceti siriani di Charles River. Comprendere la purezza dello stock animale fornirà informazioni importanti per l'uso di questi animali negli studi terapeutici SARS-CoV-2 e se è possibile sfruttare questa conoscenza per lo sviluppo di un criceto più graveSARS-CoV-2modello. Nel nostro studio, abbiamo anche identificato la sovraregolazione di geni infiammatori chiave, come IL{0}} e TNF nei polmoni e nei turbinati nasali, a conferma di precedenti modelli immunitari nei criceti[32,37]. Questi risultati sono importanti poiché è stato dimostrato che questi marcatori infiammatori sono predittori di malattie gravi attraverso la valutazione del sangue negli esseri umani[38-42]. Un'analisi più approfondita della risposta dell'ospite a SARS-CoV-2 nei tessuti respiratori dei criceti è stata effettuata utilizzando l'analisi del sequenziamento del trascrittoma[43,44]. Hoagland e colleghi hanno valutato i polmoni diSARS-CoV-2criceti infettati per la regolazione del gene immunitario dell'ospite e hanno riscontrato un'importante sovraregolazione di IL-6, TNF e IL-1beta[43] coerente con i nostri risultati della PCR. In un altro studio, l'analisi del sequenziamento unicellulare ha rivelato una risposta prominente delle cellule T, inclusa la sovraregolazione di IFN-gamma e IL-2[44], due marcatori che abbiamo anche notato essere altamente espressi nei polmoni. Inoltre, le nostre analisi dei polmoni hanno rivelato una sovraregolazione dei marcatori delle cellule T CD3, CD4 e CD8A. È importante sottolineare che l'analisi qRT-PCR che abbiamo riportato nel nostro presente studio è in accordo con questi altri studi, convalidando così l'uso di qRT-PCR come metodo per valutare rapidamente l'efficacia dei vaccini e delle terapie valutate nel criceto SARS-CoV{{ 13}} modello. I nostri profili qRT-PCR forniscono biomarcatori mirati che possono essere facilmente impiegati. Il nostro studio e l'interpretazione erano limitati dalla presenza solo dell'analisi della patogenesi. Gli studi futuri dovrebbero utilizzare il nostro pannello di bersagli immunitari da utilizzare nei vaccini e negli studi terapeutici.

La risposta antivirale è essenziale per il controllo iniziale di un virus mediante la distruzione attiva della replicazione virale e la stimolazione immunitaria per limitare la diffusione ad altre cellule. Dopo aver identificato la presenza di un virus o di antigeni virali, l'induzione degli interferoni è fondamentale per l'instaurazione di uno stato antimicrobico all'interno delle cellule in cui l'equilibrio tra gli interferoni e altre citochine innate è fondamentale per un'azione efficace[45]. Recentemente, l'inibizione degli interferoni di tipo I (IFN-alfa e IFN-beta) è stata associata a una grave malattia inCOVID-19suggerendo che il virus è in grado di bloccare l'immunità antivirale portando ad un aumento della patogenesi [14,46,47]. Nel nostro studio, abbiamo scoperto che i criceti infettati daSARS-CoV-2hanno una risposta IFN di tipo II prototipo. Al contrario, la risposta di tipo IIFN è sottoregolata, come evidenziato dalla diminuzione dell'espressione del gene IFN-beta e dall'aumento dell'espressione del gene IRF2, un antagonista di tipo I. Numerosi studi hanno dimostrato risposte IFN alterate di tipo I a seguito di infezione da SARS-CoV-2 in vitro[14,{5}}]. La disregolazione dell'IFN che riportiamo qui non è stata ancora analizzata nel tessuto respiratorio degli esseri umani con graveCOVID-19, ma le analisi immunitarie sistemiche del sangue hanno indicato risultati simili[14,46,47,52]. Sebbene i meccanismi che inibiscono le risposte dell'interferone di tipo I non siano stati completamente chiariti, fattori virali e dell'ospite sono stati implicati in questa disregolazione[53,54].

La disregolazione della risposta all'interferone è una strategia impiegata dai virus per eludere l'immunità dell'ospite. Precedenti indagini sulla risposta dell'ospite all'infezione da SARS-CoV (sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 1) e MERS-CoV (sindrome respiratoria del Medio Oriente coronavirus) suggeriscono che più coronavirus utilizzino questa strategia[55-59]. Lo studio del 2020 di Xia et al. determinato questa disregolazione utilizzata dai coronavirus altamente patogeni si estende aSARS-CoV-2dimostrando che tutti e tre questi beta-coronavirus sottoregolano la via dell'interferone di tipo I. In particolare, NSP1, NSP6 e NSP13[50] interferiscono con la traduzione di IFN-beta, bloccando il ribosoma ospite nel caso di NSP1[60] o prendendo di mira le proteine ​​a monte necessarie per l'induzione di IFN-beta nel caso di NSP13[61]. AltroSARS-CoV-2proteine ​​virali sono state anche implicate nella downregulation dell'interferone[62]. ORF3b e ORF9b mirano entrambi specificamente a un complesso proteico di segnalazione antivirale mitocondriale al fine di inibire la segnalazione di IFN di tipo I [63,64]. Fattori dell'ospite che influenzanoSARS-CoV-2gli esiti dell'infezione includono età e sesso; inoltre, comorbidità sono state implicate anche nella disregolazione dell'interferone[65]. Uno studio del 2020 di Trouillet-Assent et al. ha esaminatoCOVID-19esiti dei pazienti in una coorte comprendente individui che esprimono sistematicamente IFN di tipo I e individui che avevano livelli significativamente più bassi sia di IFN-alfa che di beta. Hanno scoperto che i pazienti privi di espressione di interferone di tipo I erano più anziani e avevano maggiori probabilità di essere maschi rispetto a quelli che esprimevano IFN di tipo I[66. In uno studio simile, sono stati identificati livelli sistemici di IFN-alfa2 significativamente più elevati nelle femmine rispetto ai livelli nei maschi|67]. Nel nostro recente studio, abbiamo scoperto che i furetti maschi adulti più anziani avevano una risposta ritardata all'interferone di tipo I rispetto alle femmine adulte, con i maschi privi di induzione di geni antivirali essenziali tra cui OASL, MIX1 e IDG15 che coincideva con un aumento della carica virale [68] .Nel nostro presente studio utilizzando il modello del criceto, tutti i nostri animali erano maschi, suggerendo che è necessaria un'indagine sui pregiudizi sessuali per ottenere una piena comprensione della nostra disregolazione dell'interferone di tipo I osservata. Al momento, non è noto perché o come i fattori dell'ospite influenzino le risposte dell'interferoneSARS-CoV-2. Uno studio di Bastard et al. ha identificato la presenza di autoanticorpi contro gli interferoni di tipo I nei maschi con graveCOVID-19[69]. Ciò offre una possibile spiegazione dei meccanismi immunitari coinvolti nella diminuzione delle risposte dell'interferone di tipo I in un sottogruppo di pazienti umani. Il meccanismo per ridurre le risposte all'interferone nel nostro presente studio, in cui tutti i criceti erano animali maschi adulti, attende ulteriori indagini. Inoltre, nel loro insieme, il profilo immunitario che abbiamo identificato insieme alla patologia delle vie respiratorie suggerisce che i criceti siano un modello ideale per esplorare questi meccanismi e testare terapie come gli interferoni di tipo [48,49,70] o l'interferone lambda [Z1, Z2], entrambi hanno dimostrato efficacia nel trattamentoCOVID-19pazienti [Z3-75] ma sono necessarie ulteriori ricerche.

COVID-19è una malattia che coinvolge la patogenesi degli organi sia respiratori che non respiratori[25,26, tuttavia poco si sa circa la risposta dell'ospite al di fuori delle vie respiratorie. Nel nostro studio, abbiamo identificato il vRNA in diversi tessuti al di fuori del tratto respiratorio, inclusi il linfonodo mediastinico, il cuore, i reni, il fegato, la milza e l'intestino crasso. La presenza di RNA virale può essere un indicatore della replicazione del virus vivo e dell'infezione dei tessuti, ma può anche essere presente senza un virus vivo. Non abbiamo trovato virus vivo significativo al di fuori del tratto respiratorio suggerendo una minima eventuale infezione degli organi extrapolmonari. Tuttavia, la presenza di RNA virale può essere significativa per la malattia clinica e i meccanismi associati. La presenza di RNA virale potrebbe essere il risultato di un virus nel sangue che viene trasportato per via sistemica o di un antigene virale che è stato trasportato dalle cellule presentanti l'antigene a tessuti immunologicamente importanti, come la milza e il linfonodo mediastinico. La presenza di RNA virale può svolgere un ruolo nelle risposte immunitarie e nella patogenesi associata all'interno di questi tessuti. Pertanto, abbiamo continuato a studiare le risposte dell'ospite immuno-correlate nei tessuti che erano positivi per l'RNA virale. Sebbene abbiamo riscontrato una sovraregolazione dei geni infiammatori e dell'interferone di tipo II in tutto il tessuto non polmonare, la risposta più sorprendente è stata l'aumento delle citochine immunomodulatorie nel cuore. All'interno del cuore, la nostra analisi ha identificato l'aumento delle citochine tra cui IL-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-5R, IL{ {12}}, CD14 e CCR3 in cui alcuni trascritti di mRNA di citochine sono aumentati di 100- volte. Sebbene alcune citochine selezionate qui possano essere prodotte da diversi sottoinsiemi di cellule T, l'assenza di TGF-beta suggerisce che la presenza di cellule T-regolatrici è meno probabile. Inoltre, l'assenza di IL-13 diminuisce la probabilità di una risposta TH2. Oltre ai linfociti T, l'aumento dell'espressione genica di IL-10, TNF e IL-6 potrebbe essere attribuito a monociti o macrofagi[76]. Ciò è ulteriormente supportato dall'aumento di CD14[76]. L'espressione di IL-5, IL-5R, IL{28}} e CCR3 suggerisce anche la presenza di eosinofili[77]. Un gran numero di studi clinici ha ora rilevato un coinvolgimento cardiaco inCOVID-19[78-84]. In effetti, si stima che circa il 30 per cento delle persone si sia ripresoCOVID-19avere qualche tipo di danno cardiaco85]. Uno studio tedesco su 100COVID-19i pazienti hanno scoperto che l'infiammazione miocardica era comune anche mesi dopo il recuperoSARS-CoV-2infezione[84]. All'interno della coorte testata, il 78% dei pazienti ha manifestato sintomi cardiaci indipendentemente dal loro grado diCOVID-19gravità[84]. I monociti sono tra i tipi cellulari noti per infiltrarsi nel cuore nell'infiammazione miocardica, producendo IL-10, IL-1beta, IL{3}} e TNF [86], oltre a IL-12[87,88], tutte sovraregolate nel cuore post-SARS-CoV-2inoculazione nel nostro presente studio. Inoltre, un altro sottoinsieme di problemi cardiaci relativi aCOVID-19è stato attribuito agli eosinofili con conseguente miocardite eosinofila[89]. È noto che altri virus causano miocardite eosinofila dopo l'infezione[90-93]. Questa patologia deriva tipicamente dal virus che infetta i tessuti del cuore, ad esempio con l'infezione da Coxsackievirus B3[94]. La miocardite eosinofila è stata diagnosticata inCOVID-19pazienti, dopo di che l'autopsia il tessuto cardiaco ha mostrato infiltrazione di cellule infiammatorie inclusi linfociti, macrofagi e, soprattutto, eosinofili [89]. In questo caso, è stato riscontrato l'aumento degli eosinofili e l'infiammazione complessiva nel cuore nonostante la mancanza di virus vivi nel cuore al momento della morte[95]. Abbiamo trovato prove nel nostro studio sulla miocardite eosinofila nell'istopatologia e anche nella firma delle citochine trovata nel cuore. È possibile nel nostro studio che gli eosinofili portino a cardiomiopatia infiammatoria mediata attraverso la sovraregolazione di IL-4, che è stata aumentata in termini di espressione genica nel cuore dei criceti l'8° giorno di inoculazione post-SARS-CoV-2. Anche un aumento del potassio e un leggero aumento dell'alanina transferasi nel plasma di criceti infetti possono aver supportato la disregolazione cardiaca. Con questo in mente, i meccanismi che regolano il danno cardiaco correlato al COVID-19 non sono ancora noti. Considerando la prevalenza del coinvolgimento cardiaco inCOVID-19pazienti, sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere i meccanismi della malattia. Qui abbiamo fornito prove che i criceti possono essere utili per comprendere i meccanismi che definiscono il danno cardiaco duranteSARS-CoV-2infezione e valutare le terapie per questa patologia.

Immunologicamente, le nostre analisi nella milza e nei linfonodi mediastinici suggeriscono l'induzione dell'immunità adattativa. Il linfonodo mediastinico ha identificato una notevole regolazione bifasica nei geni correlati alle cellule T, con sovraregolazione nell'espressione genica di CD3, CD4, IL-2, IL-21, I-10, IL{ {6}}, IL-5 e IL-13 nei giorni 2 e 15. Questo profilo suggerisce la presentazione precoce dell'antigene all'interno del linfonodo drenante subito dopo l'infezione polmonare da parte delle cellule dendritiche, che sarebbe supportata di giorno in giorno 2 sovraregolazione della produzione di IL-12 nel linfonodo [96,97]. La migrazione delle cellule dendritiche che porta all'attivazione delle cellule T culmina infine nella crescita e proliferazione delle cellule T stimolanti IL-2[98]. Anche i livelli di globulina nel sangue il giorno 2 dopo l'infezione nei criceti infetti supportano la stimolazione antigenica precoce. La sovraregolazione di IL-4, IL-5 e IL-13 suggerisce una risposta distorta TH2[99]. I primi studi hanno dimostrato che asintomatico o lieveCOVID-19casi con un'inclinazione immunitaria verso un TH2 sistemico caratterizzato da aumenti di IL-4 e IL-10[100].IL-10, una citochina regolatrice, è stata anche sovraregolata il giorno 2 del nostro studio. I nostri dati suggeriscono che le cellule T attivate vengono reclutate nei tessuti con un'infezione virale viva come i turbinati nasali, dove abbiamo osservato un aumento dei geni correlati alle cellule T il giorno 5 dopo l'inoculazione. La sovraregolazione secondaria dei geni nel linfonodo il giorno 15 suggerisce anche un'espansione dei sottoinsiemi di cellule T. In assenza di virus infettivi in ​​questo momento, questo potrebbe essere un aumento dei sottoinsiemi di cellule T che contribuiscono direttamente allo sviluppo di una risposta di memoria. Poiché i linfociti T della memoria centrale producono anche IL-2[101], i nostri dati che mostrano un aumento dell'IL-2 al giorno 15 dopo l'inoculazione possono essere indicativi della memoria dei linfociti T. IL-21 era il gene correlato alle cellule T più sovraregolato il giorno 15.IL-21 è prodotto principalmente dalle cellule helper T-follicolari, un sottoinsieme che aiuta le cellule B del centro germinale[102], in particolare l'inclinazione di B cellule verso la maturazione dell'affinità e lo sviluppo della memoria. Anche il marcatore delle cellule B CD19 è stato aumentato nel linfonodo, con il picco di espressione genica che si è verificato il giorno 15. Uno studio del 2021 di Lakshmanappa et al. ha valutatoSARS-CoV-2infezione nei macachi rhesus, rivelando una robusta risposta dei linfociti T nel linfonodo mediastinico con aumenti specifici di CD4, nonché marcatori di cellule helper follicolari T CD28 e CXCR5[103]. È possibile che l'aumento dell'espressione genica delle cellule T osservata nel nostro studio sia anche indicativo di una risposta del centro germinale. Un'elevata risposta dei linfociti T sistemici è stata osservata anche in pazienti con SARS-CoV-2 che recuperano e sviluppano la memoria a lungo termine [97,104]. Un'analisi più approfondita con un aumento dei marcatori delle reazioni del centro germinale per la valutazione dei linfonodi sarebbe utile per gli studi sui vaccini.

L'elevata attività linfonodale potrebbe anche essere indicativa di patogenesi. Il linfonodo era l'unico organo non respiratorio in cui è stato rilevato il virus vivo. Infezioni virali vive del linfonodo, così come della milza, sono state osservate negli esseri umani che hanno ceduto aSARS-CoV-2[105]. In uno studio di Kaneko et al., campioni di linfonodo e milza umani da defuntiCOVID-19i pazienti erano privi di cellule BCL6 più B e di interi centri germinali in generale. Gli autori hanno ipotizzato che questa fosse la causa della scarsa risposta umorale aSARS-CoV-2[106]. Poiché abbiamo identificato una robusta risposta anticorpale neutralizzante che è stata rilevata entro il giorno 8 dopo l'infezione che ha coinciso con una diminuzione della diffusione virale, è più probabile che il virus vivo trovato nei linfonodi del nostro studio fosse indicativo di risposte funzionali dei linfociti B e reazioni del centro germinativo.

La milza ha anche mostrato risposte immunitarie prominenti caratterizzate da un aumento dell'espressione genica linearmente dal giorno 8 al giorno 15. Questa sovraregolazione tardiva è correlata al tipico coinvolgimento splenico con la risposta immunitaria ai patogeni che si verificherebbe dopo l'attivazione nei linfonodi drenanti locali[107]. La milza, un organo linfoide, attiva anche i linfociti T e B in risposta all'antigene virale. L'elevata espressione genica di CD3, CD4, IL{5}} e I-21 è indicativa di cellule T-follicolari come così come l'attività delle cellule B dipendente dal centro germinale, come abbiamo visto nel linfonodo[108]. Inoltre, la risposta nella milza può essere una conseguenza della viremia, in cui le cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) sono coinvolte nel riconoscimento dell'antigene virale tramite TLR7 e TLR9 per l'attivazione dei linfociti T CD8 più e dei linfociti T (NKT) Natural Killer. Entrambi questi tipi cellulari funzionano nell'eliminazione delle cellule infettate viralmente dopo l'attivazione nella milza da parte di IFN-beta e IL-12 [109], che sono stati aumentati nel nostro modello, insieme a CD8.IL-12 , IL-10 e CD14 erano sovraregolati nella milza di criceti infetti, indicando potenzialmente l'attività fagocitica dei macrofagi[110,111]. Inoltre, le cellule linfoidi innate (ILC) nella milza supportano la riparazione dei tessuti in risposta alla lesione e producono IL-5 e IL-13[112]. Nel complesso, questa risposta successiva nella milza indica la funzione di riciclo della milza, nonché la potenziale attivazione dei linfociti per le risposte della memoria a lungo termine.

L'intestino crasso ha mostrato una regolazione minima delle citochine valutate, con la notevole eccezione di I-5, IL-5R e CCR3. L'espressione di tutti e tre questi geni è aumentata in modo significativo nei giorni da 2 a 15 con un picco di variazione di piega di 74 per IL-5, rispetto al basale il giorno 8. IL-5 è secreto principalmente dal T di tipo 2 -cellule helper ed eosinofili[113]. Dati i livelli di espressione genica inferiori di altri geni correlati a Th2, come IL-4 e IL-13, e l'aumento dei marcatori eosinofili conosciuti IL-5R e CCR3, è probabile che IL{ {18}} è prodotto principalmente da eosinofili che possono essere visti nella nostra analisi istologica dell'intestino crasso. Gli eosinofili svolgono un ruolo diretto nella difesa antivirale, come evidenziato dalle RNasi nei loro granuli e sono stati associati alla clearance di altri virus respiratori[114,115]. Un gran numero di eosinofili si trova anche nel tratto gastrointestinale[116]. Nel nostro studio, l'intestino crasso di criceti infetti non ha mostrato virus vivi. L'intestino crasso era, invece, positivoSARS-CoV-2RNA virale nei giorni 2 e 5 dopo l'inoculazione, un risultato coerente con Sia et al., che hanno anche osservato vRNA nel colon in assenza di una risposta infiammatoria[20]. Fino al 20 percento diCOVID-19i pazienti riferiscono sintomi gastrointestinali come diarrea[39,117]con virus che vengono versati nelle feci[118]. Ciò potrebbe essere spiegato dalla diminuzione degli eosinofili che sono stati segnalati nei casi di graveCOVID-19[119-121]. L'aumento dell'espressione del gene IL-5 da parte degli eosinofili potrebbe contribuire allo stato antivirale dell'intestino crasso, prevenendo così l'infezione. Sono necessarie ulteriori indagini per confermare l'esatto tipo di cellula che porta a questa aumentata risposta IL-5.

Nel nostro studio abbiamo anche studiato la chimica del sangue diSARS-CoV-2criceti siriani infettati. Abbiamo determinato un intervallo di riferimento utilizzando criceti non infetti provenienti dalla nostra fonte animale e abbiamo confrontato le letture con gli intervalli di riferimento pubblicati per i criceti, in particolare i criceti siriani[122]. Alcuni fattori preanalitici che possono influenzare la chimica del sangue dei nostri animali prima dell'infezione che devono essere presi in considerazione per l'analisi includono il livello di stress a cui possono essere sottoposti gli animali e l'anestetico isoflurano utilizzato durante il prelievo del sangue che può alterare la chimica del sangue. È stato dimostrato che i livelli di glucosio, ALT, ALP e fosforo inorganico erano significativamente più elevati nei ratti sotto isoflurano e altri anestetici non indicati qui[123]. Nel nostro studio sui criceti infetti da SARS-CoV-2, uno dei i cambiamenti più importanti dopo l'infezione includevano le concentrazioni di potassio che aumentavano nel tempo. Il potassio, che è una base, funge da tampone per lo scambio di idrogeno (H') (acido) quando un paziente è in uno stato acido. Poiché l'acidosi ematica può essere causata da alterazioni della funzione respiratoria, non sorprende che i criceti che hanno mostrato segni di polmonite/distress respiratorio (suggerendo un aumento dell'anidride carbonica (CO2) siano trattenuti (o espulsi meno) e meno ossigeno ( O2) essere assunto a causa della ridotta funzione alveolare) entrerebbe in uno stato acido che porta ad aumenti di potassio nel sangue. Per quanto riguarda i livelli di albumina più bassi rispetto al nostro intervallo di riferimento, ci si sarebbe aspettato che l'albumina aumentasse in risposta all'espressione di citochine infiammatorie. È possibile che i livelli più bassi di albumina siano dovuti all'uso di isoflurano che è stato mostrato in precedenza[122-124]. Per quanto riguarda il glucosio nel tempo, la maggior parte degli animali infetti ha avuto un aumento della concentrazione di glucosio suggerendo stress indotto da cortisolo, eccitazione indotta da epinefrina o disregolazione nella produzione di insulina o interazione secrezione/recettore. In sintesi, il risultato più interessante di questa analisi è stato il suggerimento di una diminuzione dei livelli di ossigeno associata a un aumento dei livelli di potassio. Questi risultati suggeriscono che il monitoraggio del potassio può essere utilizzato per identificare la polmonite durante la parte in vita diCOVID-19studi sugli animali. Andando avanti, questo lavoro può essere utilizzato anche per costruire valori di riferimento per il modello di infezione SARS-CoV-2 del criceto siriano ed essere utilizzato per lo screening in vita delle terapie.

Il nostro studio offre importanti spunti di riflessioneSARS-CoV-2infezione eCOVID-19regolazione della malattia. I modelli preclinici sono la pietra angolare della ricerca biomedica e offrono la capacità di isolare sperimentalmente i meccanismi della malattia e anche di valutare potenziali contromisure mediche, inclusi farmaci immunomodulatori, antivirali e vaccini. ComeSARS-CoV-2emerse per la prima volta, avevamo una comprensione limitata dei meccanismi della patogenesi, nessuna terapia o profilassi identificata e nessun modello preclinico da sfruttare per la scoperta di contromisure mediche. Dal momento dell'emergenza virale, sono stati fatti enormi passi avanti soprattutto nello sviluppo di modelli preclinici, ma la nostra comprensioneCOVID-19e le sue numerose manifestazioni sono ancora limitate. Il nostro studio ha confermato il trofismo virale e la patologia respiratoria precedentemente individuata nel nsSARS-COV-2studi sui criceti, ma è stato anche in grado di estendere la nostra comprensione della regolazione immunitaria e della patogenesi all'interno del tratto respiratorio e oltre.

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Nota:quanto sopra non è un elenco di riferimento completo