La quercetina sopprime la produzione infiammatoria di citochine nell'artrite reumatoide nei sinoviociti simili a fibroblasti

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Astratto.L'artrite reumatoide (AR) è una malattia autoimmune cronica, progressiva e sistemica caratterizzata principalmente da sinovite multiarticolare simmetrica. La quercetina ha attività antinfiammatoria, antiossidante e di regolazione immunitaria e quindi mostra un alto valore medicinale. Il presente studio mirava a osservare l'effetto della quercetina sui sinoviociti simili ai fibroblasti (FLS) nell'AR. I sinoviociti simili ai fibroblasti dell'artrite reumatoide (RAFLS) sono stati pretrattati con 50 nmol/l di quercetina per 2 ore e sono stati quindi stimolati utilizzando TNF-a per 24 ore per esperimenti successivi. I RAFLS sono stati trasfettati con una breve trascrizione specifica (si)-X-inattiva (XIST), microRNA (miR)-485mimico, miR-485inibitore o si-PSMB8 o combinazione. ELISA, PCR e western blotting sono stati utilizzati per valutare l'effetto della quercetina sui RAFLS trattati con TNF -un. È stato rivelato che la quercetina ha inibito la produzione di citochine infiammatorie e l'espressione di XIST nei RAFLS indotti dal TNF-a. L'analisi bioinformatica ha indicato che XIST fungeva da spugna per miR-485 e che il tipo di subunità proteasoma-8 (PSMB8) era un bersaglio diretto di miR-485. Inoltre, PSMB8 ha funzionato come un soppressore nella produzione di citochine infiammatorie di RAFLS indotta da TNF-a. Nel complesso, è stato osservato che la quercetina inibisce la produzione di citochine infiammatorie e l'espressione di XIST nei RAFLS indotti dal TNF-a. Inoltre, il silenziamento XIST potrebbe sopprimere la reazione infiammatoria spugnando miR-485 nelle cellule trattate con TNF-a. Complessivamente, la quercetina potrebbe sopprimere lo sviluppo di RA in vitro.

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introduzione

L'artrite reumatoide (AR) è una malattia infiammatoria comune caratterizzata da infiltrazione di cellule infiammatorie che porta alla degenerazione della sinovia, della cartilagine articolare e dell'osso (1). L'insorgenza e lo sviluppo di RA comportano il rilascio di un gran numero di infiammatoricitochinee mediatori, che provoca la distruzione irreversibile della cartilagine e dell'osso nell'articolazione (2). Con l'aumento dell'invecchiamento della popolazione nella società umana, l'incidenza dell'AR ha mostrato una tendenza crescente nei paesi sviluppati dal 1995 al 2001 (3,4). Attualmente, il trattamento dell'AR si basa su farmaci antinfiammatori non steroidei, glucocorticoidi, metotrexato e altri metodi sintomatici per controllare la malattia. Questi farmaci possono migliorare i sintomi dell'AR, ma l'uso a lungo termine ha forti effetti collaterali tossici, come l'inibizione della funzione immunitaria del corpo (5). Pertanto, trovare farmaci sicuri ed efficaci per il trattamento dell'AR è di grande importanza.

La quercetina è il bioflavonoide più importante nella dieta umana ed è ampiamente presente nei fiori, nelle foglie e nei frutti delle piante (6,7). La quercetina ha attività antinfiammatoria, antiossidante e di regolazione immunitaria (8,9), e quindi mostra un alto valore medicinale. Studi clinici hanno dimostrato che la quercetina ha un buon effetto nell'alleviare l'artrosi del ginocchio, nonché il dolore alle articolazioni reumatoidi e al corpo dopo l'esercizio (10-12). I sinoviociti simili ai fibroblasti (FLS) sono le principali cellule effettrici e possono rilasciare una varietà di citochine infiammatorie, aggravando la progressione dell'AR (13,14). Inoltre, il TNF-a può promuovere l'attivazione e il riassorbimento osseo degli osteoclasti e può indurre l'espressione di altri fattori infiammatori, molecole di adesione e proteasi associate all'osso e alla cartilagine; quindi, provocando l'ispessimento dello strato di rivestimento sinoviale e aggravando ulteriormente la risposta infiammatoria delle articolazioni (15). Il presente studio, quindi, mirava a osservare l'effetto della quercetina sui FLS in RA ed esplorare il possibile meccanismo diquercetinanel trattamento della RA.

Materiali e metodi

Coltura cellulare. Le cellule primarie RAFLS sono state ottenute da The Cell Bank of the Type Culture Collection dell'Accademia cinese delle scienze (cat. n.408-05a). Tutte le cellule sono state mantenute in DMEM (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) contenente il 10 percento di FBS (HyClone; Cytiva) 100 U/ml di penicillina e 100 ug/ml di streptomicina in un'incubatrice a 37 gradi. Dopo la coltura per 24 ore, i RAFLS sono stati pretrattati con 50 nmol/l di quercetina (MilliporeSigma) per 2 ore a 37 gradi e quindi sono stati stimolati usando 50 ng/ml di TNF-a per 24 ore a 37 gradi per i seguenti esperimenti.

Cistanche può migliorare l'immunità

Trasfezione cellulare. Piccoli (si)-RNA interferenti che prendono di mira XIST (si-XIST; concentrazione finale, 20 nM) e il suo controllo negativo criptato (NC) siRNA (concentrazione finale, 20 nM), miR-485inibitore (concentrazione finale, 30 nM) e il controllo dell'inibitore criptato (miR-NC; concentrazione finale, 30 nM) e miR-485 imita (concentrazione finale, 15 nM) e il controllo mimico criptato (mimici miR-NC; concentrazione finale, 15 nM) sono stati ottenuti da Shanghai Gene Pharma Co., Ltd. Un totale di RAFLS lx10 gradi sono stati piastrati in piastre a sei pozzetti per 12 ore, quindi i costrutti sono stati trasfettati in RAFLS miscelando con il reagente Lipofectamine*2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 37 gradi per 15 minuti seguendo le istruzioni del produttore . Per un totale di 24-72 h dopo la trasfezione, le cellule trasfettate sono state raccolte per esperimenti successivi. Le sequenze delle molecole trasfettate erano le seguenti:si-XIST, 5'-GCAAAUGAAAGCUACCAAU-3'; si-NC, 5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3'; inibitore miR-485, 5'-UCACCGGAGCCGAACGAACAA-3'; anti-miR-NC, 5'-CAGUACUUUUUGUGUGUAGUACAAA-3';miR-485 imita, 5'-GUCAUACACGGCUCUCCUCUCUCU-3'; miR-NC, 5'-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3!

Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). La concentrazione di citochine infiammatorie nei RAFLS trasfettati e non trasfettati (IL-1, IL{3}} e IL-8) è stata determinata utilizzando i kit ELISA (cat. n. KE00021, KE00139 e KE00006; Proteintech Group, Inc.) seguendo il protocollo del produttore. Un lettore di micropiastre è stato utilizzato per leggere l'assorbanza a 450 nm.

Analisi PCR quantitativa di trascrizione inversa (RT-q). Gli RNA cellulari totali sono stati estratti da RAFLS trasfettati e non trasfettati utilizzando il reagente TRIzol" (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). La sintesi di cDNA è stata eseguita utilizzando Maxima Probe qPCR Master Mix (Fermentas; Thermo Fisher Scientific, Inc.) secondo le istruzioni del produttore. L'analisi quantitativa dell'espressione di XIST e PSMB8 è stata eseguita utilizzando il reagente SYBROPremix Ex Taqm (Takara Bio, Inc.) ed è stato utilizzato GAPDH come controllo endogeno. Le condizioni di termociclaggio erano le seguenti: 94 gradi per 3 minuti; 40 cicli di 94 gradi per 30 secondi, 55 gradi per 30 secondi e 72 gradi per 1 minuto e 72 gradi per 10 minuti. Il livello di espressione di miR-485 è stato analizzato utilizzando il kit SYBRO PrimeScript"M miRNA RT-PCR (Takara Biotechnology Co., Ltd. ) e U6 piccolo RNA nucleare è stato utilizzato come riferimento interno. Le condizioni di termociclaggio erano le seguenti: denaturazione a 95 gradi per 10 secondi; 40 cicli di 95 gradi per 5 secondi e 60 gradi per 20 secondi; seguita dall'analisi della curva di dissociazione a 95 gradi per 60 secondi, 55 gradi per 30 secondi e 95 gradi per 30 secondi. I primer sono stati acquistati da Sangon Biotech Co., Ltd. e le sequenze di primer erano le seguenti: GAPDH Forward, 5-CTTGGTATCGTGGA AGGACTC-3' e reverse, 5'-GTAGAGCAGGGATGATGATG TTCT-3'; U6 avanti, 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTA AAAT-3' e retromarcia, 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC AT-3'; IncRNA XIST avanti, 5'-AATGGAACGGCTGA GTTTTAC-3' e retromarcia, 5'-TCATCCGCTTGCGTTCAT AG-3'; miR-485 avanti, 5'-CAGAGCTGGCCGTGAT-3 e indietro, 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGTCCGAGGTA TTCGCACTGGATACGACGAATTC{55}}'; PSMB8 avanti, 5'-GCTGCCTTCAACATAACATCA-3' e retromarcia, 5'-CTG CCACCACCACCATTA-3! L'espressione relativa è stata analizzata utilizzando 2-AACq(16).

macchia occidentale. La proteina totale è stata isolata dai RAFLS utilizzando un tampone di lisi RIPA pre-freddo (Beyotime Institute of Biotechnology) incluso un inibitore della proteasi. La proteina totale è stata quantificata utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​BCA (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Un totale di 30 campioni di proteine ​​ug per corsia sono stati separati dal 10% di SDS-PAGE e successivamente trasferiti su una membrana di nitrocellulosa (MilliporeSigma). Le membrane sono state bloccate con il 5% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora. Successivamente, le membrane sono state incubate per una notte a 4 gradi con anticorpi primari mirati contro PSMB8(1:1,000; cat. no. abl80606) e GAPDH (1:1,000; cat.no. abl81602)(tutto da Abcam). Le membrane sono state incubate con un anticorpo secondario IgG anti-coniglio marcato con perossidasi di rafano (1:1,000;sc-2027; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) a temperatura ambiente per 1 ora. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un kit di rilevamento ECL (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.) e analizzate con il software Quantity One v4.6.2 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). GAPDH è stato utilizzato come controllo del caricamento.

Saggio reporter della luciferasi. I frammenti XIST e le regioni PSMB{0}}'-non tradotte contenenti siti di legame wild-type (WT) o mutante (MUT)miR-485 sono stati ottenuti da Shanghai GenePharma Co., Ltd. Sono stati clonati nella lucciola vettore reporter del gene della luciferasi pmiRGLO (Promega Corporation). Il plasmide è stato sintetizzato da Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. Quindi, 48 ore dopo la trasfezione utilizzando il reagente LipofectamineD 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 37 gradi con il 5% di CO, il test della luciferasi è stato eseguito utilizzando il kit del sistema di test reporter della doppia luciferasi (Promega Corporation ) secondo le istruzioni del produttore. L'attività della luciferasi è stata analizzata utilizzando un lettore multimodale a tubo singolo Modulus (Promega Corporation) rispetto all'attività della luciferasi Renilla. Sono state utilizzate le seguenti sequenze: XIST-WT Forward, 5'-CGCCAGCTTCGACAATTCGAC-3 e reverse, 5'-ACT TGAAGCGGCCATACGTTGACAA-3';XIST-MUT avanti, 5'-TCAAAACCCAACTAGAGGACGATTTGTGA-3 ', e viceversa, 5'-AACCCAGAAAACCGTACGGCAATCGT-3';

PSMB8-WT avanti, 5'-CCGCTAAGTCCGAGTAGTCA-3', e retromarcia, 5'-ATAAGAATGCGGCCGAATTCATGG GAA-3'; e PSMB8-MUT avanti, 5-TTAGGACACGCA TCGGATTACGCTATTAT-3', e retromarcia, 5'-GACACCTGT TTACGGCTACCCGCAAATATGCCAA-3'.

Analisi bioinformatica. I siti di legame tra miR{0}} e XIST, nonché miR-485 e PSMB8, sono stati previsti da StarBase v2.0 (http://www.microrna.gr/lncBase) o Software TargetScan v7.1 (http://www.targetscan.org/vert_71/), rispettivamente.

Analisi statistica. Tutti i dati misurati sono espressi come media ± deviazione standard. Le differenze sono state calcolate con il test t di Student accoppiato per i confronti tra due gruppi o ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Dunnett o Tukey per confronti multipli. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc.) e SPSS 14.0 (SPSS, Inc.).P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="" difference.="" experiments="" were="" repeated="" three="">

Risultati

La quercetina inibisce la produzione di citochine infiammatorie e l'espressione di XIST nei RAFLS indotti dal TNF-a. Sotto la stimolazione del TNF-a, la concentrazione di citochine infiammatorie (IL-1, IL-6 e IL-8) e il livello di espressione di XIST erano significativamente sovraregolati nei RAFLS rispetto a quelli del NC(Fig. IA e B). Tuttavia, il trattamento con quercetina potrebbe sopprimere notevolmente la promozione del TNF-a nella produzione di citochine infiammatorie e il livello di espressione di XIST è stato notevolmente ridotto nei FLS (Fig. IA e B). Questi risultati hanno indicato che la quercetina potrebbe sopprimere la reazione infiammatoria nei RAFLS indotta dal TNF-a.

XIST funge da spugna per miR{{0}}. Successivamente, sono stati esplorati i potenziali meccanismi molecolari e sono stati previsti i possibili bersagli di XIST utilizzando il database StarBase v2.0.

L'analisi bioinformatica ha indicato che miR-485 aveva un potenziale sito di legame con la sequenza XIST (Fig.2A). È stato dimostrato che la trasfezione con il mimico miR-485 sovraregola l'espressione di miR-485 nei RAFLS (Fig.2B). Nel frattempo, il miR-485 imita l'attività della luciferasi marcatamente repressa nel tipo selvaggio XIST rispetto a quella nell'NC (Fig.2C). Il TNF-a potrebbe sottoregolare significativamente il livello di espressione di miR-485 nei RAFLS, che è stato salvato dalla quercetina (Fig. 2D). XIST era significativamente sottoespresso nei RAFLS dopo la trasfezione con si-XIST (Fig. 2E). Inoltre , il silenziamento XIST ha promosso significativamente l'espressione di miR-485, che è stata invertita dall'inibitore di miR-485 in RAFLS trattato con TNF-a (Fig.2F). Questi risultati hanno indicato che XIST ha interagito con miR-485.

PSMB8 è un obiettivo diretto di-485. Secondo l'analisi TargetScan, è stato identificato un sito di legame putativo altamente conservato con miR-485 nella regione non tradotta del PSMB8 3' (Fig. 3A). Il miR -485 mimic ha represso in modo significativo la fluorescenza nel tipo selvaggio PSMB8 rispetto a quella nell'NC (Fig. 3B). Il TNF-a potrebbe sovraregolare significativamente il livello di espressione di PSMB8in RAFLS, che è stato invertito dalla quercetina (Fig. 3C). L'inibitore miR-485 potrebbe sottoregolare significativamente il livello di espressione di miR-485 nei RAFLS (Fig. 3D). Inoltre, l'espressione di PSMB8 è stata significativamente ridotta nei RAFLS dopo la trasfezione con si-PSMB8 ( Fig. 3E).miR-485 L'inibitore potrebbe migliorare significativamente l'espressione di PSMB8 a livello di mRNA e proteine, che è stato abolito da si-PSMB8 nei RAFLS trattati con TNF-a (Fig. 3F). Questi risultati hanno indicato che miR-485 ha preso di mira direttamente PSMB8.

PSMB8 funziona come un soppressore nella produzione di citochine infiammatorie nei RAFLS indotti da TNF-a. Dopo la trasfezione con si-PSMB8, le concentrazioni di citochine infiammatorie (IL-1, IL{5}} e IL-8) sono state significativamente ridotte nei RAFLS trasfettati trattati con TNF-a rispetto a quelli non trasfettati cellule trattate con TNF-a (Fig.4A). Inoltre, la quercetina ha soppresso la reazione infiammatoria nei RAFLS sotto stimolazione del TNF-a, che

è stato salvato mediante trasfezione con si-PSMB8 (Fig.4B). Questi risultati hanno indicato che il PSMB8 potrebbe sopprimere la reazione infiammatoria nei RAFLS indotti dal TNF-a.

Discussione

In quanto prodotto attivo naturale delle piante, la quercetina è un metabolita secondario isolato ed estratto dalle piante di Fagaceae mediante la chimica medicinale naturale (17). Negli anni precedenti, è stato verificato che la quercetina inibisce la risposta infiammatoria in una serie di malattie, compresi i tumori maligni ( 18), mellito diabetico (19) e aterosclerosi (20). Il presente studio ha valutato il ruolo della quercetina sullo sviluppo dell'AR. Si ipotizza che una volta attivati ​​i fibroblasti nella patogenesi dell'AR, verranno prodotti una serie di fattori infiammatori ed enzimi di degradazione della matrice extracellulare per mediare la risposta infiammatoria, causando la progressiva distruzione di osso e cartilagine e influenzando la qualità

gravemente della vita (21,22). Il presente studio ha osservato che la quercetina ha soppresso la produzione di citochine infiammatorie di FLS indotta da TNF-a.

As a class of non-coding transcripts, IncRNAs are >200 nucleotidi di lunghezza e regolano l'espressione genica a livello epigenetico, trascrizionale e post-trascrizionale (23,24). lncRNA XIST è stato originariamente identificato nella regolazione dell'inattivazione dell'X nella cellula somatica di mammifero femminile (25). Ricerche precedenti suggeriscono che l'espressione deregolata di XIST è coinvolta nella reazione infiammatoria di alcune malattie tra cui la nevralgia infiammatoria e la polmonite acuta (26,27). Coerentemente con la ricerca precedente, il presente studio ha rilevato che il livello di espressione di XIST è stato sovraregolato negli FLS indotti da TNF-a, che è stato abolito dalla quercetina. Gli ncRNA possono regolare l'espressione genica spugnando i miRNA (28). L'analisi bioinformatica ha indicato che miR-485 aveva un potenziale sito di legame con la sequenza XIST.cistanche deserticola maInoltre, il livello di espressione di miR-485 è stato sottoregolato negli FLS trattati con TNF-a. Inoltre, il silenziamento di XIST ha promosso efficacemente l'espressione di miR-485 nelle cellule dopo la trasfezione.

I miRNA possono indirizzare la regione 3'-non tradotta degli mRNA per controllare l'espressione genica (29).effetti di cistanceIl presente studio ha rivelato che PSMB8 è un bersaglio diretto di miR-485. PSMB8 può funzionare come subunità dell'immunoproteasoma per indurre una risposta infiammatoria come segue. Yamagishi (30) ha riportato che l'inibizione specifica del PSMB8 può diminuire la secrezione di fattori infiammatori, ritardando così la risposta infiammatoria del diabete mellito. Koerner et al (31) hanno rivelato che il coinvolgimento di PSMB8 nella risposta infiammatoria è strettamente associato allo sviluppo del cancro del colon-retto. Il presente studio ha rivelato che il TNF-a potrebbe sovraregolare significativamente il livello di espressione di PSMB8 nei RAFLS. Inoltre, si-PSMB8 potrebbe inibire la concentrazione di citochine infiammatorie nei RAFLS trattati con TNF-a. Inoltre, la quercetina non poteva sopprimere la reazione infiammatoria nei RAFLS trattati con si-PSMB8 sotto stimolazione del TNF-a. Questi dati hanno suggerito che il PSMB8 funziona come un soppressore nella produzione di citochine infiammatorie nei RAFLS indotti dal TNF-a.

Il presente studio ha osservato che la soppressione della produzione di citochine infiammatorie da parte della quercetina in FLS indotta da TNF-a è promettente in vitro. Tuttavia, l'effetto in vivo e l'effetto della farmacocinetica e della penetrazione della membrana sinoviale sulla quercetina devono ancora essere studiati. Pertanto, sono previsti ulteriori studi per tentare di studiare l'effetto della quercetina sull'AR in vivo.

Insomma,cistanche deserticheil presente studio ha osservato la produzione inibita dalla quercetina di citochine infiammatorie e l'espressione di XIST nei RAFLS indotti da TNF-a. Inoltre, il silenziamento di XIST potrebbe sopprimere la reazione infiammatoria spugnando miR-485 nelle cellule trattate con TNF-a. Complessivamente, la quercetina potrebbe sopprimere lo sviluppo di RA in vitro.

Questo articolo è estratto da Ricevuto il 17 giugno 2020; Accettato l'11 giugno 2021DOI: 10.3892/etm.2021.10695