Approfondimenti strutturali e funzionali sul polimorfismo della fibrilla -sinucleina Parte 4

7. Separazione di fase e nucleazione: basi molecolari del polimorfismo delle fibrille

Subito dopo la scoperta che l'aggregazione -Syn non è legata solo alla PD ma anche alla MSA e alla DLB, l'area di ricerca chiave si è concentrata principalmente sulla comprensione della capacità di una proteina di causare disturbi neurodegenerativi clinicamente e patologicamente diversi.

Invecchiando, potresti scoprire che la tua memoria non è più buona come quando eri bambino. A volte potresti persino sentire che il tuo cervello è "arrugginito" ed è difficile ricordare nuove informazioni. Ma cosa si può fare per migliorare questa situazione? La ricerca degli ultimi anni ha dimostrato che esiste una stretta relazione tra MSA (complesso dopamina-saccaride) e memoria.

L'MSA è un circuito neurale che coinvolge il neurotrasmettitore dopamina. La dopamina è un importante neurotrasmettitore nel cervello ed è correlato alle emozioni, alla motivazione e al movimento. Le pietre solari sono nuclei nel cervello che controllano il movimento e coordinano il movimento. La relazione con la dopamina è che quando il corpo basale viene stimolato dalla dopamina, aumenterà le connessioni tra i neuroni cerebrali, favorendo così la formazione e il consolidamento della memoria.

La ricerca mostra che la MSA può essere attivata e stimolata attraverso giochi digitali, allenamento musicale, esercizio fisico e interazione sociale. Queste modalità possono rafforzare la connessione con il liquido cerebrospinale aumentando il rilascio di dopamina. Ad esempio, è stato dimostrato che esercizi statici per il cervello, come il Sudoku e i cruciverba, migliorano le capacità di memoria. È stato anche dimostrato che l’allenamento musicale stimola i circuiti MSA e migliora le capacità di memoria. Inoltre, è stato dimostrato che l’esercizio fisico e l’interazione sociale hanno un impatto positivo sull’attivazione della MSA, promuovendo così la salute del cervello e il miglioramento della memoria.

In sintesi, poiché le attività dell’MSA hanno un impatto positivo sulla memoria, trovare e partecipare ad attività che stimolano l’MSA è un passo importante per migliorare la memoria. Essere fisicamente attivi, partecipare ad attività sociali e apprendere nuove abilità può attivare e stimolare il circuito MSA, promuovendo così una migliore salute del cervello e della memoria. Cominciamo da ora e partecipiamo attivamente a queste attività per iniettare nuova energia e vitalità nel nostro cervello. Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria perché la Cistanche deserticola è un materiale medicinale tradizionale cinese che ha molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia di Cistanche deserticola deriva dai numerosi principi attivi che contiene, tra cui acido tannico, polisaccaridi, glicosidi flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono promuovere la salute del cervello in vari modi.

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Negli ultimi anni, l’ipotesi del ceppo prionico è emersa come la principale spiegazione della variabilità della malattia osservata nelle sinucleinopatie. Sebbene una serie di dati biofisici e biologici supportino l'esistenza dei ceppi -Syn [29,30,32–35,53], non è ancora chiaro come abbiano origine questi ceppi e i fattori che guidano la loro formazione in vivo.

La risposta probabile potrebbe risiedere nel delineare i percorsi di aggregazione e nel discernere i driver molecolari alla base della formazione del ceppo. La formazione dell'amiloide non è solo governata dalla nucleazione primaria ma è dominata da eventi di nucleazione secondaria durante gran parte della fase di crescita dell'aggregazione, come discusso in precedenza [189].

Questa nucleazione secondaria comporta l'allungamento di nuove fibrille dai semi esistenti reclutando monomeri dalla soluzione. Qualsiasi cambiamento nelle condizioni di soluzione delle fibrille tende ad alterare la velocità degli eventi di nucleazione primaria e secondaria [188,189]. Ad esempio, il pH acido migliora il legame dei monomeri -Syn alla superficie delle fibrille, aumentando così la velocità di nucleazione secondaria [189,302].

Poiché la propagazione degli aggregati indotta dai semi è attribuita alla frammentazione e all'allungamento dei semi delle fibrille, ciò porta a ipotizzare che il fenomeno dello stiramento sia, almeno in parte, una conseguenza della nucleazione secondaria. Inoltre, più specie coesistono in diversi stadi della cinetica di aggregazione [17,303,304], suggerendo il coinvolgimento degli intermediari di aggregazione nel dettare il polimorfismo.

La mappatura dello spazio conformazionale del monomero -Syn rivela una sottopopolazione strutturale del monomero -Syn che ne promuove il legame con le membrane e induce la formazione di vari oligomeri e fibrille [170].

Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che la nucleazione eterogenea durante il percorso di aggregazione costituisce la base dell'origine del polimorfismo [252]. Abbiamo generato due diversi polimorfi, HMF (fibrille maturate dall'elica) e PMF (fibrille premature), dagli intermedi di aggregazione formati nelle stesse condizioni di assemblaggio.

I PMF non hanno un nucleo amiloide stabile e possiedono un contenuto di bobina casuale insieme ad elementi -sheet. Inoltre, il foglio -strutturato dei residui 74–79 è assente dal suo dominio NAC (residui 65–80), suggerendo che i PMF siano fibrille meno ordinate tipi. Al contrario, gli HMF morfologicamente e strutturalmente distinti sono più compatti e ben ordinati con un nucleo fibrillare stabile [252].

Questi contengono superfici idrofobiche altamente esposte e sono potenzialmente più tossici dei PMF meno ordinati. Questi polimorfi mostrano non solo differenze strutturali ma mostrano anche diverse attività biologiche [252].

Uno studio simile che prevedeva l'identificazione degli intermedi di aggregazione in presenza di una membrana fosfolipidica ha rivelato che le specie prefibrillari contengono due regioni ad ansa con residui da 57 a 61 e da 71 a 80 [305]. Questi intermedi poi si riorganizzano in specie fibrillare con la maggior parte della regione NAC e l'N-terminale (residui 38-80) che formano parte della conformazione fibrillare finale [305].

Sono stati riportati studi anche con aggregati di A, PrP e tau, dove emanano proprietà biologiche distinte a causa di differenze strutturali tra i polimorfi [28,306–309]. Ad esempio, fibrille A morfologicamente e strutturalmente diverse formate in condizioni quiescenti e agitate mostrano differenze significative nella tossicità nei neuroni primari, con le fibrille quiescenti che sono più tossiche rispetto ad altre [28].

Una serie di conformazioni PrPSc strutturalmente diverse mostrano tropismo della cellula ospite, con un insieme specifico di ceppi che prendono di mira preferenzialmente neuroni, astrociti o anche entrambi [307,308]. Pertanto, i ceppi -Syn risultanti dalla nucleazione eterogenea nel percorso di aggregazione possono causare variazioni cliniche e patologiche nella PD esibendo citotossicità variabile e diverse proprietà simili ai prioni (Figura 5).

Recentemente, l'evoluzione del concetto di aggregazione proteica verso un fenomeno più fondamentale, vale a dire la separazione di fase liquido-liquido (LLPS), ha influenzato significativamente il campo e ha indirizzato la ricerca in una nuova direzione [310–314]. Le proteine ​​vengono incubate in condizioni variabili, ad esempio pH, temperatura e condizioni saline [315–317].

Gli eventi di separazione di fase vengono promossi in presenza di affollatori molecolari, come polietilenglicole, destrano o ficoll, che aiutano ad aumentare la concentrazione proteica locale e a facilitare la formazione di goccioline [315-318]. Successivamente, la dinamicità, la maturazione e il profilo di aggregazione vengono studiati utilizzando una combinazione unica di metodi biofisici, biochimici e spettroscopici [315,317].

È stato dimostrato che i fenomeni di separazione di fase di varie proteine ​​amiloidogeniche precedono l'aggregazione e la formazione di fibrille. È stato suggerito che la presenza di regioni con disordine intrinseco (IDR), domini simili a prioni (PLD) e domini a bassa complessità (LCD) promuovono la formazione di condensati fase-separati delle proteine ​​amiloidogeniche [310,315,316,319,320].

Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che l'LLPS di -Syn è un evento critico nella fase di latenza iniziale e precede la sua aggregazione in condizioni di separazione di fase (presenza di crowders, fattori di stress, cofattori amiloidi, ecc.) [315].

La comparsa di queste goccioline fase separate nella fase di ritardo della cinetica di aggregazione suggerisce che gli LLP potrebbero potenziare gli eventi di nucleazione aumentando la concentrazione locale delle molecole proteiche [315,320]. Inoltre, le goccioline -Syn separate in fase subiscono la transizione da liquido a solido con il tempo e determinano la formazione di idrogel amiloide [315].

È stato precedentemente dimostrato che questi idrogel di amiloide intrappolano oligomeri e fibrille citotossiche [321], indicando la possibilità che le fibrille formate tramite LLPS possano essere tossiche. Tuttavia, in normali condizioni di assemblaggio (senza separazione di fase), le fibrille -Syn mostrano una citotossicità molto scarsa o nulla [322,323]. Ciò suggerisce che le fibrille formate in condizioni di separazione di fase e non di separazione di fase potrebbero essere diverse.

Inoltre, la formazione di fibrille nelle soluzioni diluite (noto che avviene tramite nucleazione primaria e secondaria) [189] e quella all'interno dei condensati (tramite LLPS) non sono eventi mutuamente esclusivi [324], ma diversi percorsi di aggregazione possono portare alla formazione di fibrille diverse (Figura 6).

Ad esempio, la TDP-43, una proteina coinvolta nella SLA/FTD, va incontro a fibrillazione con o senza LLPS. Tuttavia, la cinetica della fibrillazione in entrambi i casi è diversa, suggerendo il coinvolgimento di processi complessi nella fibrillazione in presenza di LPS [329].

Pertanto, sarebbe molto rilevante porre alcune domande, ad esempio se le fibrille formate con o senza subire la separazione di fase sono strutturalmente e funzionalmente distinte l'una dall'altra o, in poche parole, mostrano polimorfismo delle fibrille. Se diverse condizioni o mutazioni LLPS abbiano qualche ruolo nel decidere il comportamento di deformazione delle fibrille -Syn formate?

Ad esempio, è stato dimostrato che le mutazioni patogene nella FUS presentano proprietà biofisiche diverse rispetto alla proteina wild-type [327]. Questi risultati suggeriscono che, analogamente alle condizioni di non separazione di fase in cui diverse condizioni di soluzione danno origine a polimorfi [29], anche le fibrille formate nelle diverse condizioni di separazione di fase potrebbero essere diverse (Figura 7).

Ad esempio, la fase -Syn che si separa in condizioni diverse, come la presenza di PTM, mutazioni familiari, piccole molecole o ioni metallici, può mostrare polimorfismo e formare diversi tipi di fibrille (Figura 7).

Tuttavia, questo fenomeno deve ancora essere determinato in quanto richiederebbe un'ampia caratterizzazione delle fibrille formate all'interno delle goccioline. Crediamo che la coesistenza di specie intermedie conformazionalmente distinte e una moltitudine di percorsi di aggregazione osservati con o senza LLPS potrebbero costituire la base dell'origine del polimorfismo .

Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche in questo campo per delineare il contributo della nucleazione eterogenea e dei percorsi di aggregazione multipla al polimorfismo delle fibrille. Lo sviluppo e l'applicazione di varie tecniche biofisiche potrebbero aiutarci a ottenere informazioni approfondite sugli eventi molecolari che si verificano durante l'LLPS e la successiva maturazione delle goccioline.

8. Implicazioni cliniche e terapeutiche del polimorfismo

Gli studi discussi nella revisione forniscono prove conclusive che -Syn può formare diversi polimorfi con proprietà strutturali e biologiche distinte. Similmente ai prioni, dove ciascuna malattia da prioni è codificata da una distinta conformazione della proteina mal ripiegata, ciascuna sinucleinopatia è anche possibilmente associata ad una struttura -Syn unica.

Tuttavia, le diverse strutture fibrillare per la stessa proteina pongono diverse sfide nello sviluppo di farmaci contro i disturbi neurodegenerativi. Terapie come l’immunoterapia sarebbero altamente specifiche per un particolare ceppo ma potrebbero non riuscire a riconoscerne uno diverso. Allo stesso modo, lo sviluppo di piccole molecole terapeutiche o farmaci per bloccare o rallentare il processo di aggregazione delle proteine ​​deve essere sottoposto a screening per molteplici conformazioni. Considerando la complessità delle fibrille e il loro polimorfismo, prendere di mira la -Syn monomerica potrebbe essere un'opzione.

Tuttavia, ciò rappresenta anche una sfida a causa della natura intrinsecamente disordinata della proteina. Nonostante queste sfide, l'individuazione e la caratterizzazione dei ceppi -Syn derivati ​​dai pazienti aprirà una finestra di opportunità per una comprensione e una caratterizzazione più profonde delle sinucleinopatie. Faciliterà lo sviluppo di nuove terapie e sistemi di classificazione più robusti delle sinucleinopatie.

In questo contesto, tecniche altamente sensibili come PMCA [330], test di conversione indotta da quaking in tempo reale (RT-QuIC) [331] e HANdaiamyloid burst inducer (HANABI) [332] hanno contribuito in modo significativo ad amplificare i -synaggregati dal liquido cerebrospinale dei pazienti cervelli. PMCA e RT-QuIC sono stati utilizzati per discriminare rispettivamente tra i ceppi -Syn derivati ​​da pazienti PD/MSA e PD/DLB [52,333].

L'impiego di queste tecniche aiuterebbe a monitorare la progressione della malattia nel tempo e aiuterebbe nella diagnosi precoce e specifica delle sinucleinopatie. Inoltre, le differenze cliniche e patologiche e l'eterogeneità da paziente a paziente osservate nella malattia di Parkinson e nei disturbi correlati potrebbero influire sul modo in cui i pazienti con sinucleinopatia dovrebbero essere trattati. A partire da ora, tutti i pazienti con malattia di Parkinson ricevono lo stesso tipo di trattamento e non viene fatta alcuna distinzione tra i pazienti a seconda di come hanno acquisito la malattia e di quali sintomi presentano.

Pertanto, prevediamo che i farmaci e gli agenti terapeutici progettati per colpire le specie -Syn patogene potrebbero comportare l'uso di un singolo farmaco conformazionale o di un cocktail di farmaci contro diversi polimorfi o ceppi che sono popolati nel cervello umano malato. Inoltre, diversi parametri chiave dovrebbero essere considerati caso per caso, come il profilo della malattia, i sintomi patologici e clinici, i tipi e la natura dei ceppi proteici coinvolti e il tasso di progressione della malattia durante il trattamento di pazienti con sinucleinopatie.

Pertanto, identificare potenziali bersagli terapeutici e progettare farmaci basati sulla conformazione è il prossimo grande passo verso lo sviluppo di farmaci contro la malattia di Parkinson e i disturbi correlati. Stabilire il collegamento tra la propagazione dell'astrain e il fenotipo della malattia fornirà preziose informazioni sullo sviluppo di strategie efficaci per combattere i disturbi neurodegenerativi.

Un’altra sfida è fornire farmaci al cervello per trattare i disturbi neurodegenerativi, che devono affrontare principalmente battute d’arresto dovute alle barriere ematoencefaliche restrittive [32]. Sono stati fatti numerosi tentativi per somministrare farmaci attraverso nanovettori, metodi di somministrazione diretta dei farmaci, interruzione transitoria della barriera emato-encefalica e terapie con cellule staminali [33-37]. Tuttavia, nessuno dei trattamenti è stato in grado di superare completamente le sfide attuali [32].

9. Considerazioni conclusive e domande aperte

Il comportamento del ceppo simile al prione di -Syn è ancora un fenomeno enigmatico. È sorprendente come una singola proteina priva di una struttura adeguata possa ripiegarsi in molti modi diversi e adottare conformazioni che provocano varie patologie.

Molte domande senza risposta necessitano di ulteriori indagini, anche dopo una quantità impressionante di lavoro sui polimorfi e sui ceppi -Syn. Ad esempio, cosa guida la formazione del ceppo -Syn in determinate condizioni cellulari e ambientali? In che modo questi ceppi prendono di mira diversi tipi di cellule e regioni del cervello? I ceppi -Syn si evolvono, cambiano o si adattano nel tempo a seconda dei fattori ospiti?

In che modo la presenza di altre proteine, ligandi, membrane o cofattori influenza la formazione del ceppo? I ceppi -Syn hanno la capacità di incrociarsi tra loro e provocare patologie miste? I ceppi -Syn interferiscono e bloccano la propagazione reciproca, analogamente ai prioni?

È possibile o disponiamo di tecniche abbastanza sensibili da discriminare tra i ceppi di PD e MSA in una fase iniziale della diagnosi? Considerando l'espansione del fenomeno del ceppo prionico a molte altre proteine ​​amiloidogeniche, potrebbe anche essere necessario comprendere gli eventi molecolari chiave nella biologia del ceppo e progettare strategie efficaci.

Contributi dell'autore: Concettualizzazione, SM e indagine SKM (revisione della letteratura); SM;LG; RB e ASS; stesura-preparazione bozza originale, SM; LG; RB e ASS; scrittura-revisione e editing, SM; LG; RB; ASS e SKM; visualizzazione, SM; amministrazione del progetto, SM e SKM; supervisione, SM e SKM; acquisizione di finanziamenti, SKM, SM e SKM contribuiscono ugualmente agli autori corrispondenti. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento: questa ricerca è stata finanziata dal Dipartimento di Biotecnologia (DBT) [BT/PR22749/BRB/10/1576/2016], governo indiano.

Dichiarazione del Comitato di Revisione Istituzionale: Non applicabile.

Dichiarazione di consenso informato: non applicabile.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: non applicabile.

Ringraziamenti: Gli autori riconoscono il Dipartimento di Biotecnologia (DBT), governo indiano per il sostegno finanziario. Ringraziamo Pradeep Kadu per il suo aiuto nella realizzazione delle figure. SM è grata alla University Grants Commission of India per la sua borsa di studio.

Conflitti di interessi: gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Abbreviazioni

-sinucleina ( -Syn), morbo di Parkinson (PD), atrofia multisistemica (MSA), demenza con corpi di Lewy (DLB), demenza da morbo di Parkinson (PDD), corpi di Lewy (LB), neuriti di Lewy (LN), morbo di Alzheimer (AD ), inclusioni citoplasmatiche gliali (GCI), modifiche post-traduzionali (PTM), wild-type (WT), microscopia crioelettronica (cryo-EM), spettroscopia NMR allo stato solido (ssNMR); microscopia elettronica a trasmissione (TEM), microscopia a forza atomica (AFM), dicroismo circolare (CD), nucleo motore dorsale del nervo vago (DMV), sistema nervoso enterico (ENS); -Sinucleina (sin); -sinucleina (-Syn); Amplificazione ciclica del misfolding delle proteine ​​(PMCA); Separazione di fase liquido-liquido (LLPS).

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