Espressione specifica del tessuto del recettore SARS‑CoV‑2, enzima 2 di conversione dell'angiotensina, in modelli murini di malattia renale cronica

edmund.chen@wecistanche.com

Da gennaio 2020, la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), è un problema di salute pubblica globale. L'infezione da SARS-CoV-2 si instaura quando la proteina S virale si lega all'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) ospite ed entra nella cellula1,2. Pertanto, un'elevata espressione di ACE2 negli organi che sono potenziali bersagli di SARS-CoV-2 può aumentare il rischio di infezione da COVID- 19. L'ACE2 è un enzima che svolge un ruolo importante nel sistema renina-angiotensina (RAS), dove converte l'angiotensina (Ang) II in Ang1-7 e forma un componente dell'ACE2-Ang{{21 }}Asse del recettore MAS3. Esercita anche un effetto di protezione degli organi contrastando l'attività dell'asse del recettore ACE-Ang II-angiotensina di tipo 1 (AT1)4–7. Rapporti precedenti hanno dimostrato che ACE2 altera i suoi modelli di espressione tessuto-specifici in varie condizioni, tra cui malattie cardiovascolari, diabete mellito (DM) emalattie renali 8–11. L'espressione polmonare di ACE2, che è particolarmente importante per l'infezione da SARS-CoV-2, è ridotta nella sindrome da distress respiratorio acuto indotta da lipopolisaccaridi12. Un altro rapporto mostra che l'espressione di ACE2 è più alta negli uomini più anziani13. Presso il Department of Medical Science and Cardiorenal Medicine, Yokohama City University Graduate School of Medicine, 3‑9 Fukuura, Kanazawa‑ku, Yokohama 236‑0004, Giappone. 2Programma sui disturbi cardiovascolari e metabolici, Duke-NUS Medical School, Singapore, Singapore. 3Dipartimento di Medicina, Mount Sinai Beth Israel, New York, NY, USA. 4Dipartimento di Biologia Molecolare, Scuola di Laurea in Medicina della Yokohama City University, Yokohama, Giappone. 5Dipartimento di Otorinolaringoiatria, Chirurgia della Testa e del Collo, Scuola di Medicina, Yokohama City University, Yokohama, Giappone. 6 Medicina interna, Kanagawa Dental University.

Parole chiave;malattie renali; reni; renale ACE2; tessuti renali; insufficienza renale

CISTANCHE MIGLIORA LA MALATTIA RENALE/RENALE

Inoltre, l'espressione nasale e branchiale di ACE2 è maggiore negli adulti rispetto ai bambini14. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, pochi studi hanno esaminato come l'espressione polmonare di ACE2 sia alterata in altre malattie. Pazienti con cronicomalattie renali(CKD) presentano un rischio di malattia grave da COVID-19, ma non ci sono prove dell'aumento della prevalenza di COVID-19 nei pazienti con insufficienza renale cronica15-21. Considerando il fatto che ACE2 è necessario per l'infezione da COVID-19, questi risultati possono suggerire che l'espressione polmonare di ACE2 non è migliorata nei pazienti con insufficienza renale cronica. In particolare, l'espressione cellulare di ACE2 è presumibilmente associata alla suscettibilità al rischio di infezione da SARS-CoV, che è correlata a SARS-CoV-222. Anche il fatto che i bambini con una bassa espressione di ACE2 siano meno suscettibili al COVID-19 rispetto agli adulti23 supporta queste ipotesi. Pertanto, abbiamo condotto esperimenti per esaminare i cambiamenti nell'espressione polmonare ACE2 in due tipi di topi modello CKD: indotta da adenina (cioè topi adenina) e indotta da acido aristolochico (AA) (cioè topi AA) per affrontare questa ipotesi. È stata anche studiata la relazione dell'espressione di ACE2 con i bloccanti RAS. Finora, è stato dimostrato che l'uso di bloccanti RAS sovraregola l'espressione dell'organo ACE2 in alcuni casi24-27. Recenti indagini epidemiologiche hanno dimostrato che l'uso di bloccanti RAS non aumenta il rischio di COVID-1928-30. Inoltre, l'espressione di ACE2 nei polmoni non è stata migliorata quando i bloccanti RAS sono stati somministrati a topi normali31. Tuttavia, non sono stati segnalati gli effetti dei bloccanti RAS sull'espressione polmonare di ACE2 nel contesto dell'insufficienza renale cronica; questo punto è essenziale per la futura gestione del COVID-19 e delle sue conseguenze. Qui, abbiamo studiato i cambiamenti nell'espressione polmonare di ACE2 a causa del trattamento con bloccanti RAS nei topi modello CKD.

RisultatiI topi modello di CKD indotta da adenina hanno mostrato una significativa perdita di peso, declino funzionale renale e pressione sanguigna (BP) elevata rispetto ai controlli. Il peso corporeo al basale (BW) e la pressione sistolica erano identici tra il gruppo di controllo e quello adenina. BW è aumentato nel tempo nel gruppo di controllo, mentre è diminuito nel gruppo adenina; questo guadagno di peso corporeo era significativamente diverso tra i gruppi (Fig. 1A). La pressione sistolica era significativamente elevata nel gruppo adenina, rispetto al gruppo di controllo, nel tempo (Fig. 1B). A 2 settimane, l'escrezione urinaria di albumina era significativamente elevata nel gruppo adenina, rispetto al gruppo di controllo (topi adenina 41.0±8,3 ug/die vs. controllo 13,6±1,7 ug/die, P<0.001; fig. 1e).="" there="" were="" also="" signifcant=""  enhancements="" of="" plasma="" creatinine="" and="" blood="" urea="" nitrogen="" (bun)="" levels="" in="" the="" adenine="" group,="" compared="" with=""  the="" control="" group="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (creatinine:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 0.22±0.01 mg/dl="" vs.="" control="" 0.10±0.01 mg/="" dl,=""><0.05; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.31±0.06 mg/dl="" vs.="" control="" 0.11±0.01 mg/dl,=""><0.01; bun:="" 2 weeks:=""  adenine="" mice="" 65.0±7.0 mg/dl="" vs.="" control="" 25.7±0.5 mg/dl,=""><0.01; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 61.7±12.5 mg/dl="" vs.=""  control="" 25.6±1.6 mg/dl,=""><0.01; fig. 1c,="" d).="" moreover,="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" adenine="" group="" (2 weeks:="" adenine="" mice="" 170±15 μl/min="" vs.="" control="" 397±25 μl/min,=""><0.001; 4 weeks:=""  adenine="" mice="" 136±29 μl/min="" vs.="" control="" 357±31 μl/min,=""><0.001;>

L'espressione di ACE2 nei reni è stata significativamente ridotta nei topi modello di CKD indotta da adenina, rispetto ai controlli, mentre l'espressione di ACE2 nei polmoni non differiva tra i gruppi.L'istologia renale ha mostrato ingrossamento eterogeneo e atrofia dei tubuli, nonché infiltrazione cellulare nelrenaleinterstitium, nei topi adenina. La colorazione ACE2 è stata osservata principalmente nei tubuli prossimali in entrambi i gruppi, ma il grado di colorazione è stato ridotto nel gruppo adenina (Fig. 2A). Livelli di proteine ​​ACE2 nelreni(stimato mediante analisi western blotting) ha mostrato una significativa riduzione nel gruppo adenina, rispetto al gruppo di controllo, sia a 2 che a 4 settimane (2 settimane: topi adenina 0.55±0.{{ 9}}4 vs. controllo 1.00±0,10, P<0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.32±0.07="" vs.="" control="" 0.90±0.07,=""><0.001; fig. 2c).="" in="">renale ACE2L'espressione dell'mRNA ha mostrato una significativa riduzione nel gruppo adenina a 2 settimane (topi adenina 0.61±0.04 rispetto al controllo 1.00±0,03, P<0.001; fig. 2e);="" a="" similar="" tendency="" for="" reduction="" was="" observed="" at="" 4 weeks,="" although="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" signifcant="" (fig. 2e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="" groups;="" ace2=""  staining="" was="" observed="" in="" type="" 2="" alveolar="" epithelial="" cells="" (fig. 2b).="" there="" were="" no="" differences="" in="" ace2="" protein="" or="" mrna="" expression="" levels="" in="" the="" lungs="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (fig. 2d,="" f).="" the="" difference="" in="" plasma="" ace2="" activity="" was="" not="" statistically="" signifcant="">

CISTANCHE MIGLIORERA' L'INSUFFICIENZA RENALE/RENALE

I topi modello di CKD indotta da AA hanno mostrato una significativa perdita di peso e un declino della funzionalità renale, rispetto al gruppo del veicolo, mentre la pressione arteriosa non differiva tra i gruppi.Il peso corporeo al basale e la pressione sistolica erano identici tra i gruppi veicolo e AA. BW è aumentato nel tempo nel gruppo veicoli, mentre è diminuito nel gruppo AA; questo guadagno di peso corporeo era significativamente diverso tra i gruppi (Fig. 3A). Tuttavia, non c'era differenza nella pressione sistolica tra i gruppi (Fig. 3B). Rispetto al gruppo veicolo, nel gruppo AA (creatinina: topi AA 0.40±{6} si sono verificati miglioramenti significativi della creatinina plasmatica e dei livelli di BUN, nonché dell'escrezione urinaria di albumina. }.03 mg/dL rispetto al veicolo 0,14±0,01 mg/dL, P<0.001; bun:="" aa="" mice="" 62.8±4.6 mg/="" dl="" vs.="" vehicle="" 29.0±1.4 ="" mg/dl,=""><0.001; urinary="" albumin="" excretion:="" aa="" mice="" 61.3±7.3 ="" μg/day="" vs.="" vehicle=""  9.5±0.9 μg/day,=""><0.001; fig. 3c–e).="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" aa="" group=""  (aa="" mice="" 72±12="" μl/min="" vs.="" vehicle="" 159±13="" μl/min,=""><0.001;>

L'espressione di ACE2 nei reni è stata significativamente ridotta nei topi modello di CKD indotta da AA, rispetto ai controlli, mentre i livelli di proteina ACE2 polmonare non differivano tra i gruppi. L'analisi istologica renale ha mostrato atrofia tubulare e infiltrazione cellulare nelrenaleinterstizio nel gruppo AA. La colorazione ACE2 è stata osservata principalmente nei tubuli prossimali in entrambi i gruppi, ma il grado di colorazione è stato ridotto nel gruppo AA (Fig. 4A). Livelli di proteine ​​ACE2 nelreniha mostrato una significativa riduzione nel gruppo AA, rispetto al gruppo veicolo (topi AA {{0}}.22±{6}}.03 vs. veicolo 1.00±0.08, P<0.001; fig. 4c).="" in="" addition,="">renale ACE2L'espressione dell'mRNA è stata significativamente ridotta nel gruppo AA (topi AA {{0}}.30±0,02 rispetto al veicolo 1.00±0,06, P<0.001; fig. 4e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="">

La colorazione ACE2 è stata osservata nelle cellule epiteliali alveolari di tipo 2 (Fig. 4B) e non c'era differenza nel livello di proteina ACE2 polmonare tra i gruppi (Fig. 4D). L'espressione dell'mRNA di ACE2 nei polmoni era significativamente più bassa nel gruppo AA rispetto al gruppo veicolo (topi AA 0.76±0.04 vs. veicolo 1.{{11} }±0,04, pag<0.01; fig. 4f).="" moreover,=""  there="" was="" a="" signifcant="" reduction="" in="" plasma="" ace2="" activity="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 84.8±2.6="" rfu/min="" vs.="" vehicle="" 98.3±3.0="" rfu/min,=""><0.01;>

Olmesartan ha attenuato i miglioramenti della PA e dell'escrezione urinaria di albumina e la riduzione della perdita di peso nei topi modello CKD indotta da adenina.Il trattamento con olmesartan ha attenuato la perdita di peso nei topi adenina (Fig. 5A). Il trattamento con olmesartan ha anche ridotto significativamente la pressione arteriosa sistolica sia nel gruppo di controllo che in quello adenina (topi adenina 131,5±0.4 mmHg vs. controllo 121.2±{7}}.7 mmHg, P<0.001; olmesartan="" mice=""  111.7±1.1 ="" mmhg="" vs.="" control="" 121.2±0.7 ="" mmhg,=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 117.2±0.9 ="" mmhg="" vs.="" adenine="" mice="" 131.5±0.4 mmhg,=""><0.001; fig. 5b).="" in="" adenine="" mice,="" olmesartan="" treatment="" improved="" plasma="" creatinine="" level="" (adenine="" mice="" 0.19±0.02="" vs.="" control=""  0.13±0.01,="" p="" <="" 0.01;="" adenine+olmesartan="" mice="" 0.14±0.01="" vs.="" adenine="" mice="" 0.19±0.02,="" p="" <="" 0.01;="" fig. 5c)="" and=""  suppressed="" urinary="" albumin="" excretion="" (adenine="" mice="" 67.9="" ±6.7 μg/day="" vs.="" control="" 18.0±3.6 μg/day,="" p=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 52.5±2.3="" vs.="" olmesartan="" mice="" 17.4±3.7 μg/day,=""><0.001; adenine-olmesartan="" mice=""  52.5±2.3 μg/day="" vs.="" adenine="" mice="" 67.9±6.7 μg/day,=""><0.05;>

Olmesartan non ha alterato l'espressione di ACE2.Nei gruppi di controllo e adenina, né l'mRNA né i livelli di espressione proteica di ACE2 nel rene sono stati alterati dal trattamento con olmesartan (Fig. 6A, C). Non ci sono stati cambiamenti nell'mRNA polmonare ACE2 o nei livelli di espressione proteica tra i gruppi di controllo e adenina (Fig. 6B, D). Inoltre, non c'era alcuna differenza significativa nell'attività plasmatica ACE2 (Fig. 6E). È stata anche esaminata l'espressione dell'mRNA di ACE2 nel tratto respiratorio superiore (faringe), ma non è stata osservata alcuna differenza significativa tra i gruppi (Figura supplementare S1).

DiscussioneLa pandemia di COVID-19 ha avuto un profondo impatto in tutto il mondo. Per gli anziani e le persone con comorbilità, le informazioni relative al rischio di infezione e alla gravità del COVID-19 sono una considerazione fondamentale. Sono stati condotti numerosi studi epidemiologici sul COVID-19 in tutto il mondo, che hanno dimostrato che i pazienti con insufficienza renale cronica hanno maggiori probabilità di sviluppare COVID-1917 grave, ma la morbilità del COVID-19 potrebbe non essere elevata nei pazienti con CKD15–21. In particolare, i risultati di diverse meta-analisi hanno rivelato che la prevalenza di CKD era dell'1,7–5,2% nei pazienti con COVID-1915–17,21. Inoltre, un'analisi di 5.700 pazienti con COVID-19 in New

L'area di York ha mostrato che l'8,5 percento aveva un sottostantemalattie renali19. Dato che la prevalenza stimata di CKD è del 9,1% in tutto il mondo18 e di circa il 15% negli Stati Uniti20, il rischio di infezione da SARS-CoV-2 potrebbe non aumentare in relazione alla presenza di CKD. ACE2 svolge un ruolo importante nella trasmissione di COVID-191,2. Inoltre, il livello di espressione di ACE2 nelle cellule delle vie aeree è associato al rischio di infezione da SARS-CoV, un coronavirus simile all'agente eziologico di COVID-1922. Poiché COVID-19 è una malattia respiratoria, l'espressione di ACE2 nei polmoni è una componente importante della trasmissione della malattia. Nel presente studio, abbiamo ipotizzato che la mancanza di aumento dell'espressione polmonare di ACE2 in CKD sia collegata all'assenza di elevata morbilità COVID-19. Questa ipotesi è supportata dal fatto che i bambini con una bassa espressione di ACE2 sono meno suscettibili al COVID-19 rispetto agli adulti. Abbiamo usato due tipi di topi modello di CKD nei nostri esperimenti per esaminare i cambiamenti nell'espressione polmonare di ACE2 in connessione con la patogenesi di CKD. L'insufficienza renale cronica indotta da adenina è un modello animale rappresentativo di malattia32. La somministrazione eccessiva di adenina può indurre CKD causandorenaleostruzione tubulare e degenerazione, così comerenalefibrosi interstiziale, dovuta alla deposizione di 2–8 diidrossiadenina32,33. Al contrario, l'insufficienza renale cronica indotta da AA è causata dall'induzione della fibrosi da danno tubulare indotto da AA34. Questi due modelli sono stati scelti perché è stato dimostrato che la BP aumenta nel modello di CKD indotta da adenina35, mentre non aumenta nel modello di CKD indotta da AA36. In particolare, l'ipertensione è una complicanza comune osservata nei pazienti con insufficienza renale cronica; abbiamo ritenuto utile indagare se la presenza o l'assenza di ipertensione influenzi l'espressione polmonare di ACE2 nella patogenesi dell'insufficienza renale cronica. I risultati hanno mostrato che ilrenale ACE2i livelli di proteine ​​sono stati ridotti in entrambi i modelli di CKD. Nei topi adenina, non c'era alcuna differenza significativa nei livelli di mRNA a 4 settimane, ma c'era una diminuzione dei livelli di proteine. Una delle ragioni di questa discrepanza potrebbe essere il coinvolgimento della repressione traslazionale. Lambert DW, et al. ha mostrato che miR-421 reprimeva la traduzione della proteina ACE2 senza influenzare i livelli di trascrizione ACE237. Un altro studio ha anche mostrato che il miR sierico-421 era aumentato nei pazienti con insufficienza renale cronica o ipertensione38,39. Pertanto, nel gruppo di topi adenina con un periodo più lungo di CKD e ipertensione (4 settimane), miR-421

potrebbe essere aumentata e soppressa la traduzione proteica, con conseguente discrepanza tra l'mRNA e l'espressione proteica. I livelli di proteina ACE2 polmonare non differivano in entrambi i modelli di CKD rispetto ai controlli e ai veicoli. Sebbene sia intrigante il fatto che l'espressione dell'mRNA polmonare ACE2 sia stata ridotta nel modello CKD indotto da AA, i nostri risultati sono stati più notevoli perché non abbiamo riscontrato differenze nei livelli di proteina ACE2 polmonare, che influenzano direttamente l'infezione da SARS-CoV{5}}. Inoltre, l'attività plasmatica dell'ACE2 non differiva in entrambi i modelli di CKD rispetto ai controlli e ai veicoli. L'ACE2 solubile nel plasma è considerato scisso e rilasciato dalle cellule dei tessuti. È stato riportato che l'aumento dell'attività plasmatica dell'ACE2 è associato a un aumento del rilascio della proteina ACE2 dai tessuti, suggerendo una diminuzione della proteina ACE2 nei tessuti40. Pertanto, i risultati del presente studio che l'attività plasmatica ACE2 non è stata modificata nello stato CKD indica che il rilascio della proteina ACE2 espressa nei tessuti non è cambiato nello stato CKD, il che supporta i risultati che l'espressione della proteina ACE2 nei tessuti è invariata in il contesto dell'insufficienza renale cronica. La relazione tra COVID-19 e bloccanti RAS è al centro delle discussioni di ricerca. Precedenti studi sugli animali hanno dimostrato che i bloccanti RAS sovraregolano l'espressione ACE2 tissutale, il che ha portato a temere che l'uso di bloccanti RAS possa aumentare il rischio di infezione da SARS-CoV-2. Tuttavia, l'uso di bloccanti RAS in quegli studi precedenti ha portato alla sovraregolazione del tessuto ACE2 solo in condizioni patologiche specifiche24,27; questa sovraregolazione non ha superato l'intervallo normale. Un altro studio che esamina polmoni erenale ACE2l'espressione nei topi normali trattati con bloccanti RAS non ha mostrato alcun aumento, rispetto al gruppo di controllo31. D'altra parte, è stato riportato che i bloccanti RAS come candesartan e captopril aumentavano l'espressione polmonare di ACE2 nei ratti normali41. Nella pratica clinica del mondo reale, alcuni studi epidemiologici riguardanti l'uso di bloccanti RAS in pazienti con COVID-19 hanno dimostrato che l'uso di tali farmaci non aumenta il rischio di COVID-1928–30. Tuttavia, l'effetto dei bloccanti RAS sull'espressione polmonare di ACE2 è ancora controverso. Nessuno studio precedente ha esaminato gli effetti dei bloccanti del RAS sull'espressione polmonare di ACE2 nel contesto dell'insufficienza renale cronica, sebbene i bloccanti del RAS siano essenziali per il trattamento dei pazienti con insufficienza renale cronica. Il presente studio è stato condotto per colmare questa lacuna nella letteratura. Per modellare più da vicino la pratica clinica del mondo reale, abbiamo utilizzato il modello CKD indotto da adenina, che mostra ipertensione simultanea. I risultati hanno mostrato che la somministrazione di olmesartan, un bloccante del RAS, non ha migliorato l'espressione polmonare di ACE2, rispetto ai controlli. Inoltre, l'espressione dell'mRNA di ACE2 nel tratto respiratorio superiore, il bersaglio iniziale dell'infezione da SARS-CoV-2, non è stata potenziata in risposta al trattamento con olmesartan.Renale ACE2i livelli di proteine ​​sono stati ridotti nel modello CKD; la somministrazione di olmesartan non ha aumentato i livelli di proteina ACE2 renale nei topi di controllo e adenina. La mancanza di ripristino nell'ACE2 renale nei topi adenina trattati con olmesartan potrebbe essere stata dovuta all'uso di un modello diverso di CKD, rispetto a uno studio precedente27, nonché alla durata relativamente breve del trattamento con un antagonista del recettore dell'angiotensina25,27. Tuttavia, il trattamento con olmesartan ha migliorato diversi parametri di insufficienza renale, inclusa l'escrezione urinaria di albumina. Questi risultati supportano l'uso continuato dei bloccanti RAS nei pazienti con COVID-19 che hanno CKD.

CISTANCHE MIGLIORERA' L'INFEZIONE RENALE/RENALE

Questo studio aveva alcune limitazioni. In primo luogo, ha esaminato solo i cambiamenti nell'espressione polmonare di ACE2 nei topi modello CKD, mentre non ha studiato direttamente l'infezione da SARS-CoV-2. In secondo luogo, in questo studio abbiamo osservato i topi adenina per 4 settimane e i topi AA per 8 settimane, ma i risultati potrebbero essere diversi in un periodo di osservazione più lungo. In terzo luogo, l'espressione di ACE2 nei polmoni può differire tra topi e umani. In quarto luogo, nei pazienti con insufficienza renale cronica, è probabile che la gravità del COVID-19 sia maggiore, ma non è possibile fare riferimento al meccanismo di gravità sottostante. In quinto luogo, non è solo il livello di espressione dell'ACE2 polmonare a determinare la suscettibilità al COVID-19, ma può anche essere influenzato da molti altri fattori. In conclusione, non abbiamo riscontrato alcun cambiamento nell'espressione della proteina ACE2 polmonare nei topi modello CKD, indipendentemente dallo stato di ipertensione. Inoltre, l'uso del trattamento con bloccanti del recettore dell'angiotensina nei topi modello CKD non ha aumentato l'espressione polmonare ACE2. Questi risultati suggeriscono l'ipotesi che il rischio di morbilità da COVID{11}} possa non essere elevato nei pazienti con insufficienza renale cronica a causa della loro espressione polmonare stabile di ACE2. I risultati forniscono anche importanti prove scientifiche di base che i bloccanti RAS possono essere utilizzati in sicurezza nel trattamento di pazienti con COVID-19 che hanno insufficienza renale cronica.

Materiale e metodi Animali.Questo studio è stato condotto in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per l'uso di animali da esperimento. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per gli studi sugli animali della Yokohama City University (numero di approvazione: FA{{{{10}}}}), che erano conformi alle linee guida ARRIVE. Sono stati compiuti sforzi per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e garantire la minima sofferenza. I topi sono stati alloggiati in un ambiente controllato con un 12- ciclo luce-buio a una temperatura di 25 gradi . Ai topi è stato concesso libero accesso a cibo e acqua. Topi modello CKD. Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando topi C57BL/6 J maschi di 8–9-settimana di età, dopo 1-settimana di acclimatazione in tutti i gruppi. Nell'esperimento con l'adenina, i topi sono stati alimentati con una dieta mista a 0,2 percento di adenina (0,2 percento di adenina più 0,3 percento di NaCl, 3,6 kcal/g, CE{{ 18}}; CLEA, Tokyo, Giappone; gruppo adenina) o una dieta standard (0,3% NaCl, 3,6 kcal/g, CE-2; CLEA; gruppo di controllo) per 2 o 4 settimane. Nell'esperimento AA, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con AA (3 mg/kg) due volte a settimana per 4 settimane, seguite da un periodo di recupero di 4-settimane; al gruppo del veicolo è stato iniettato il veicolo (75% di dimetilsolfossido). Nell'esperimento di trattamento con olmesartan, i topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi sperimentali: (1) gruppo di controllo; (2) gruppo adenina, alimentato con una dieta mista con lo 0,2% di adenina; (3) gruppo di controllo-olmesartan, trattato con l'antagonista del recettore AT1 olmesartan in acqua da bere (4 mg/kg/giorno; Daiichi Sankyo Chemical Pharma Co., Ltd, Tokyo, Giappone); e (4) gruppo adenina-olmesartan, che ha dosi identiche a quelle dei gruppi 2 e 3.

Misurazione della pressione arteriosa.La pressione sistolica è stata misurata con il metodo tail-cuf (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Giappone), come descritto in precedenza42,43. Tutte le misurazioni sono state eseguite tra le 9:{6}} e le 14:00 h. Almeno 10 misurazioni sono state eseguite in ciascun mouse e il valore medio è stato utilizzato per l'analisi.Analisi quantitativa della reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi in tempo reale.L'RNA totale è stato estratto dal polmone,renalee tessuto faringeo utilizzando ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Giappone); Il cDNA è stato sintetizzato utilizzando il sistema SuperScript III First-Strand (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). L'analisi quantitativa della reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi in tempo reale è stata eseguita utilizzando un sistema di rilevamento della sequenza ABI PRISM 7000; i prodotti di trascrizione inversa sono stati incubati con TaqMan PCR Master Mix e una sonda TaqMan personalizzata (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), come descritto in precedenza44,45. È stata utilizzata la seguente sonda TaqMan: ACE2 (Mn01159003_m1). I livelli di mRNA sono stati normalizzati a quelli dell'rRNA 18S.

Analisi Western blotting.L'espressione proteica è stata analizzata mediante western blotting utilizzando omogenati di tessuto, come descritto in precedenza45,46. In breve, l'estratto proteico totale è stato preparato dai tessuti con un tampone campione contenente dodecil solfato di sodio. La concentrazione proteica di ciascun campione è stata misurata con NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific), utilizzando l'albumina di siero bovino come standard. Uguali quantità di estratto proteico da ciascun campione di tessuto (tessuto polmonare: 24 ug, tessuto renale: 10 ug) sono state frazionate su un gel di poliacrilammide al 5-20% (Atto, Tokyo, Giappone). Le proteine ​​separate sono state quindi trasferite su una membrana di polivinilidene difluoruro utilizzando il sistema iBlot Dry Blotting (Invitrogen). Le membrane sono state bloccate per 1 ora a temperatura ambiente con soluzione salina tamponata con fosfato contenente il 5% di latte scremato in polvere. Le membrane sono state incubate con anticorpi primari per ACE2 (Ab108252 1:500 [polmone] o 1:1000 [rene], Abcam, Cambridge, MA, USA) e -actina (A{{16} }:10.000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Le membrane sono state lavate e quindi incubate con anticorpi secondari per 60 minuti a temperatura ambiente. I siti delle reazioni anticorpo-antigene sono stati visualizzati da un substrato di chemiluminescenza potenziato (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Le immagini sono state analizzate quantitativamente utilizzando un ChemiDoc Touch (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Per confrontare i livelli di espressione della proteina ACE2 nel polmone etessuti renalinei topi normali, è stato eseguito un ulteriore western blotting sulla stessa membrana (Figura supplementare S2). La quantità di proteine ​​descritte è stata frazionata in gel ((A) polmone: 24/10/1 ug, rene: 24/10/1 ug, (B) polmone: 24/12 ug , rene: 0.2/0,15/0,1 ug); è stato utilizzato lo stesso anticorpo primario per ACE2 (Ab108252 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA). Per esaminare la specificità dell'anticorpo, è stato utilizzato un peptide bloccante selettivo ACE2-(ab198988). Il western blotting ha mostrato una singola banda proteica, che è stata abolita da un peptide bloccante selettivo ACE2- (Figura supplementare S3).

Analisi immunoistochimica.Polmone erenalei tessuti dei topi sono stati fissati con paraformaldeide al 4% e successivamente incorporati in paraffina. Le sezioni spesse quattro micrometri sono state decerate e reidratate; il recupero dell'antigene è stato eseguito mediante riscaldamento a microonde. Le sezioni sono state bloccate per ridurre l'attività endogena della biotina utilizzando il reagente di blocco della perossidasi (Dako, Carpinteria, CA, USA) e trattate per 60 minuti con siero di capra normale al 10% in soluzione salina tamponata con fosfato. Le sezioni sono state quindi incubate con anticorpo anti-ACE2 diluito a 1:500 (Ab15348, Abcam). Per esaminare la specificità dell'anticorpo, l'immunocolorazione è stata anche esaminata omettendo l'Ab primario e utilizzando un peptide bloccante selettivo ACE2-(ab15352). Colorazione ACE2 nel polmone etessuto renales è stato osservato, cosa che non è stata osservata quando l'anticorpo è stato preassorbito con un peptide bloccante selettivo{0}} ACE (ab15352) o con l'omissione dell'anticorpo ACE2. (Figura supplementare S4).

CISTANCHE MIGLIORA IL DOLORE RENALE/RENALE

Analisi biochimiche.Dopo aver inalato il 5% di anestesia con isoflurano, i campioni di sangue sono stati raccolti mediante puntura cardiaca a stomaco pieno mediante punture cardiache. Gli animali sperimentali sono stati uccisi umanamente dopo l'anestesia. I campioni di sangue intero sono stati centrifugati a 3000 rpm (MR-150, Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Giappone) a 4 gradi per 10 minuti per separare il plasma. I campioni di plasma risultanti sono stati conservati a -80 gradi fino al momento dell'uso. I livelli di creatinina plasmatica, BUN, creatinina urinaria e albumina urinaria sono stati misurati utilizzando un autoanalizzatore Hitachi 7180 (Hitachi, Tokyo, Giappone).

Attività plasmatica ACE2.L'attività ACE2 è stata misurata dalla società di ricerca e sviluppo TechnoPro (Tokyo, Giappone) utilizzando il kit ACE2 Activity Assay (SensoLyte 390) a una temperatura di 27 gradi . I campioni sono stati diluiti 1:10 utilizzando il tampone del test fornito con l'ACE2 Activity Assay Kit. Il saggio è stato eseguito in 384-piastre a pozzetti. Campioni di plasma, solo tampone del test (fondo) o 4-metil-cumarina-7-ammide (0,16–5 μM) come standard di riferimento sono stati aggiunti a una piastra di reazione OptiPlate-384 F a 10 μl/pozzetto. Dieci, una soluzione di substrato ACE2 (0,05 mM 4-metilcumaril-7-ammide/Dnp nel tampone del test) è stata aggiunta a 10 μL/pozzetto. Dopo la reazione, l'intensità della fluorescenza (Ex/Em=330 nm/390 nm) è stata misurata a intervalli di 5-min per 3 ore utilizzando un lettore di piastre EnSpire (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). L'intensità di fluorescenza dei campioni in ogni momento è stata calcolata dall'intensità di fluorescenza dei campioni. La pendenza di ciascun campione (RFU/min) è stata determinata da un'approssimazione lineare del grafico durante il periodo da 30 a 90 minuti dopo l'inizio della misurazione.

Analisi statistica.I dati sono espressi come media ± errore standard della media. Le differenze sono state analizzate come segue. L'analisi della varianza a due vie, seguita dall'analisi post hoc di Bonferroni, è stata eseguita per determinare le differenze nel tempo tra adenina e gruppi di controllo (Figg. 1, 2), AA e gruppi veicolo (Fig. 3A, B) o adenina e olmesartan gruppi (Figg. 5, 6 e S1). I test t spaiati sono stati utilizzati per determinare le differenze tra AA e topi veicolo (Figg. 3C-F, 4). Valori P<0.05 were="" considered="" statistically="">