Estrazione con ultrasuoni di acidi fenolici, flavonoli e flavan-3-oli da bucce e semi d'uva moscato utilizzando solventi naturali eutettici profondi e modellazione predittiva mediante reti neurali artificiali

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AstrattoL'obiettivo di questo studio era di studiare l'efficienza di estrazione di 9 solventi eutettici profondi naturali (NDES) con l'assistenza di ultrasuoni peracidi fenolici, flavonolie flavan-3-oli nelle bucce e nei semi dell'uva moscata (Carlos) rispetto al 75% di etanolo. La rete neurale artificiale (ANN) è stata applicata per ottimizzare il contenuto di acqua NDES, il tempo di ultrasuoni, il rapporto solido-solvente e la temperatura di estrazione per ottenere i massimi rendimenti di estrazione per acido ellagico, catechina ed epicatechina. Una NDES di nuova formulazione (n. 1) è costituita da cloruro di colina:acido levulinico: glicole etilenico 1:1:2 e 20 percento di acqua hanno estratto la quantità più alta di acido ellagico nella pelle a 22,1 mg/g. Questa resa era 1.{7}}volte di quella del 75 percento di etanolo. Una NDES modificata (n. 3) composta da cloruro di colina: prolina: acido malico 1:1:1 e 30 percento di acqua ha estratto la quantità più alta di catechina (0,61 mg/g) ed epicatechina (0,89 mg/g) nella buccia e 2,77 mg/g e 0,37 mg/g nel seme, rispettivamente. La resa ottimale di acido ellagico nella pelle utilizzando NDES #1 era 25,3 mg/g (osservato) e 25,3 mg/g (previsto). La resa ottimale di (catechina più epicatechina) nei semi utilizzando NDES n. 3 era di 9,8 mg/g (osservata) e 9,6 mg/g (prevista). Questo studio ha mostrato l'elevata efficienza di estrazione di NDES selezionati per i polifenoli in condizioni ottimizzate.

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introduzione

I solventi eutettici profondi naturali (NDES) vengono preparati mescolando donatori di legami idrogeno con accettori di legami idrogeno con un rapporto molare appropriato [1]. Il punto di fusione di un componente dovrebbe essere inferiore al punto di fusione dell'altro [1]. Dopo il riscaldamento e la miscelazione, questo mezzo diventa un liquido a temperatura ambiente. L'acqua viene aggiunta per stabilizzare e polarizzare la miscela. La ricerca nel campo dell'estrazione fitochimica mediante NDES si è ampliata grazie alla loro efficace estraibilità e solubilità. Ciononostante, molteplici fattori giocano un ruolo significativo quando si confrontano le NDES con i solventi organici, inclusi resa, costo, recupero e tossicità. Precedenti ricerche hanno studiato le NDES sull'estrazione di diversi polifenoli da varie matrici alimentari. Ad esempio, Bubalo et al. (2016) hanno confrontato 5 NDES, acqua, 70% di metanolo (v/v) e acidificato il 70% di metanolo (v/v) per estrarre antociani, catechina e quercetina-3-O-glucoside dalle bucce dell'uva rossa. Un NDES costituito da cloruro di colina: acido ossalico (1:1) con il 25 percento di acqua (v/v) è risultato essere il solvente di estrazione più efficiente [2]. In un altro studio, Panic et al. (2019) hanno testato 8 NDES e acidificato il 70% di etanolo e hanno osservato il cloruro di colina: acido citrico (2:1) con il 30% di acqua (v/v) come il miglior NDES per estrarre gli antociani dalla vinaccia [3]. L'uva moscato (Vitis rotundifolia) è originaria degli stati del sud-est e la prima uva selvatica coltivata negli Stati Uniti [4]. Le uve moscato sono prodotte in 12 stati e totalizzano circa 5000 acri [5]. Esistono 100 varietà di uva moscato e ognuna varia nelle caratteristiche fisiche, sensoriali o chimiche [4]. Tra questi, Carlos è un'uva moscata ampiamente coltivata a causa delle sue elevate rese del raccolto e della consistenza crescente [4]. L'uva di moscato Carlos è di medie dimensioni, di colore bronzo, più spessa nella buccia e contiene in media quattro semi [6]. L'uva moscato contiene quantità significative dipolifenoliche sono noti per ridurre l'infiammazione [7], inibire la crescita del tumore alla prostata [8] e migliorare le risposte metaboliche dei diabetici [9]. La vinaccia d'uva moscata, un sottoprodotto della spremitura dell'uva moscata o della vinificazione, è costituita da bucce e semi. Un precedente studio di ricerca ha utilizzato acetone: acqua: miscela di acido acetico (70:29.7:0.3, v/v) per estrarre composti fenolici dai semi, dalla buccia e dalla polpa di otto cultivar di uva muscadina coltivata in Florida, compreso Carlos [10]. Tuttavia, l'uso di solventi organici infiammabili e la loro bassa efficienza di estrazione hanno ostacolato le applicazioni pratiche. La maggior parte delle vinacce di moscato viene ancora scartata come rifiuto. La rete neurale artificiale (ANN) è un sistema di mappatura non lineare composto da varie unità di elaborazione di base collegate da associazioni ponderate. Queste unità di elaborazione sono chiamate "neuroni" [11]. La rete neurale artificiale è un approccio di apprendimento automatico per prevedere o prevedere una risposta basata su più input [11]. La ricerca precedente ha applicato i metodi della superficie di risposta (RSM) per l'ottimizzazione e la previsione dell'estrazione. Tuttavia, pochi studi hanno utilizzato l'ANN per lo stesso scopo. Ad esempio, Sinha et al. (2013) hanno suggerito che ANN ha prestazioni di previsione migliori rispetto a RSM sull'estrazione di colorante naturale dai semi di Bixa Orellana (Annatto) [12]. In uno studio simile, Ciric et al. (2020) hanno riportato che il modello ANN era migliore di RSM per la previsione delle estrazioni di composti fenolici dall'aglio [13]. L'obiettivo di questa ricerca era studiare l'efficienza di estrazione di 9 NDES per acidi fenolici, flavonoli e flavan-3-oli rispetto al 75% di etanolo con l'assistenza degli ultrasuoni. L'ANN è stata applicata per prevedere e ottimizzare le condizioni di estrazione sulla resa fenolica. L'ipotesi era che le NDES con composizioni specifiche estrassero quantità maggiori di acidi fenolici, flavonoli e flavan-3-oli rispetto al 75% di etanolo, e la massima efficienza di estrazione può essere raggiunta dalla modellazione predittiva basata su ANN.

2. Materiali e metodi 2.1. Sostanze chimiche e reagenti Cloruro di colina, acido levulinico, 1,{4}}propandiolo, acido DL-malico, acido ossalico, acido cloridrico e acido formico sono stati ottenuti da Acros Organics (Morris Plains, NJ, USA). Acido lattico, glicole etilenico, glicina, acetonitrile di grado HPLC, metanolo ed etanolo sono stati acquistati da Fishers Scientific (Waltham, Massachusetts, USA). L-prolina e betaina cloridrato sono state acquistate da Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). Gli standard di grado HPLC di acido ellagico, acido gallico, acido ferulico, (più)-catechina, (-)-epicatechina, miricetina, quercetina e kaempferolo sono stati acquisiti da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.2. Progettazione di NDESLe NDES n. 1–2 nella Tabella 1 sono state progettate nel nostro studio precedente [14]. Il cloruro di colina nelle NDES n. 1–2 è stato selezionato come accettore di idrogeno, mentre per ciascuna nuova NDES sono stati selezionati due diversi donatori di idrogeno. I rapporti molari tra i donatori di idrogeno e l'accettore e il contenuto di acqua sono stati determinati in esperimenti preliminari. Le NDES n. 3–9 nella Tabella 1 sono state selezionate dalla letteratura poiché studi precedenti le hanno designate come NDES efficaci nell'estrazione dei polifenoli. Il contenuto d'acqua in NDES #3 è stato modificato dalla letteratura citata. Un metodo di riscaldamento è stato applicato per preparare le NDES [15]. In breve, l'accettore di legame idrogeno è stato miscelato con ciascuno dei componenti donatori di legame idrogeno in flaconi Erlenmeyer con un'ancoretta. La miscela nel pallone è stata chiusa e riscaldata a 50 ◦C per circa 30 min o fino a quando non si è formato un liquido limpido che è rimasto stabile a temperatura ambiente. I contenuti d'acqua nella tabella 1 sono stati calcolati in base al volume finale delle miscele NDES. Il pH delle NDES elencate nella Tabella 1 è stato misurato utilizzando un pHmetro (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 2.3. Preparazione del campione/Estrazione assistita da ultrasuoni Bucce e semi (cultivar: Carlos) d'uva moscata (Vitis rotundifolia) congelati sono stati forniti da Paulk Vineyards (Wray, Georgia, USA). Dopo aver rimosso bucce, foglie o piccioli, la sansa veniva separata in semi e pelle. I campioni sono stati quindi essiccati utilizzando un forno a vuoto (Isotemp, modello 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) a 60 ◦C e una pressione del vuoto inferiore a − 30 in.Hg. Successivamente, i campioni sono stati omogeneizzati in una polvere fine utilizzando un macinatore chimerico (A1{{105}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, Cina). Usando un rapporto solido-solvente iniziale di 1:20 (g: mL), 0,50 g di buccia o semi d'uva moscato sono stati miscelati in 10 mL di NDES o 75% di etanolo in triplicati. I campioni sono stati quindi posti a bagnomaria (60 ◦C) e sonicati (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500-Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, USA) per 30 minuti al 100 percento ampiezza per due round (15 min/round). Successivamente, i campioni sono stati immediatamente centrifugati (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, Cina) a 3.260 g fino ad ottenere un surnatante limpido. Infine, i supernatanti sono stati raccolti e conservati in un congelatore a -20 ◦C per l'analisi HPLC di acidi fenolici (acido ellagico, acido gallico, acido ferulico), flavonoli (miricetina, quercetina e kaempferolo) e flavan-3-oli (catechina ed epicatechina). 2.4. Analisi HPLC di acidi fenolici, flavonoli e flavan-3-oli Acidi fenolici, flavonoli e flavan-3-oli sono stati analizzati su un sistema HPLC (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, Germania) secondo il metodo descritto in Sandhu e Gu (2013) [16]. Il sistema HPLC è costituito da una pompa binaria, un autocampionatore, un vano colonna termostatato, un rivelatore a serie di diodi e un rivelatore a fluorescenza. Gli estratti di buccia d'uva o di semi sono stati idrolizzati prima delle analisi degli acidi fenolici e dei flavonoli. L'idrolisi è stata eseguita miscelando 1 ml dell'estratto con 4 ml di soluzione di idrolisi (HCI 1,2 M contenente il 50 percento di metanolo) e posto a bagnomaria (Precision, Modello 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta , OH, USA) a 90 ◦C per 80 min. Successivamente, i campioni sono stati raffreddati a 25 ◦C seguiti da sonicazione per 5 minuti. L'idrolisi dell'estratto non era necessaria per l'analisi della catechina e dell'epicatechina. Gli estratti idrolizzati e non idrolizzati sono stati filtrati attraverso una membrana di politetrafluoroetilene (PTFE) da 0,45 μm prima dell'analisi HPLC. Per analizzare acido ellagico, acido gallico, acido ferulico, miricetina, quercetina, kaempferol, catechina ed epicatechina, 10 µL sono stati iniettati in una colonna SB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA, STATI UNITI D'AMERICA). Le fasi mobili erano (A) 0,5 percento di acido formico e (B) 100 percento di acetonitrile. La portata era di 1 mL/min con 25 min di gradiente modificato come segue: 0–5 min, 10–30 percento B; 5–10 min, 30–40 percento B; 10–20 min, 40–50 percento B; 20–25 min, 50–10 percento B; seguito da 5 min di equilibratura. La temperatura della colonna è stata fissata a 30 ◦C. La lunghezza d'onda di rilevamento era 260 nm per acido ellagico, acido gallico e acido ferulico e 360 ​​nm per miricetina, quercetina e kaempferolo su un rivelatore a matrice di fotodiodi. L'eccitazione e l'emissione per la catechina e l'epicatechina erano rispettivamente di 230 nm, 321 nm, utilizzando un rivelatore a fluorescenza. I composti polifenolici sono stati quantificati utilizzando curve standard di acido ellagico, acido gallico, acido ferulico, miricetina, quercetina, kaempferol, catechina ed epicatechina. Tutte le curve standard avevano 7 punti e R2 > 0,99. 2.5. Design personalizzato per reti neurali artificiali Quattro variabili di estrazione indipendenti con quattro livelli: contenuto d'acqua (15–60 percento), tempo di ultrasuoni (5–35 min), rapporto solido-solvente (1:5–1:20) ed estrazione temperatura (30–60 ◦C) (Tabella S1) sono state applicate per ottimizzare la resa di estrazione di acidi fenolici, flavonoli e flavan-3-oli. A differenza dei design classici come il design della superficie di risposta, il design basato su ANN non richiede esecuzioni ripetute e preferisce una struttura dati diversa. Nel nostro studio precedente [14], l'ANN era un metodo più affidabile per prevedere la resa di estrazione rispetto a RSM. Pertanto, l'ANN è stata selezionata in questo studio per prevedere la resa di estrazione di acido ellagico, catechina ed epicatechina. Un progetto personalizzato con 40 esecuzioni (Tabella S2) è stato generato su JMP Pro (versione 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) per fornire dati specifici per la modellazione predittiva ANN. La randomizzazione delle 40 corse è stata applicata per eliminare qualsiasi distorsione. L'equazione principale di ANN è mostrata come segue: il=∑jj=1 wh jpg più bhk, k=1toK (1) dove h è il numero di neuroni nel livello nascosto, j e k sono rispettivamente il numero di variabili di input e neuroni nascosti, p è la variabile di input, bh è il bias dello strato nascosto e wh è il peso nello strato nascosto. I rendimenti di estrazione di acido ellagico, catechina ed epicatechina in relazione alle quattro variabili indipendenti sono stati analizzati utilizzando l'ANN addestrando prima i dati e quindi scegliendo il miglior tipo di attivazione e un numero di neuroni che si traduce in un adeguato adattamento dei dati. Per valutare il successo dei modelli di predizione, sono stati valutati tre valori: R-quadrato, la radice quadrata dell'errore di previsione medio al quadrato (RASE) (equazione (2)) e l'errore medio assoluto (AAE). RASE è RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) Dove SSE dona per quadrato e somma gli errori di previsione (differenze tra le risposte effettive e le risposte previste) e n per un numero di osservazioni. R-quadrato vicino a 1 con RASE e AAE vicino a zero significa un maggiore adattamento dei dati al modello. 2.6. Statistiche Le rese di estrazione di acidi fenolici, flavonoli e flavan-3-oli sono state confrontate con l'ANOVA unidirezionale seguito dal test t di Student a p Minore o uguale a 0,05 utilizzando JMP Pro (versione 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Ciascun nde e 75 percento di etanolo sono stati confrontati utilizzando i test di Dunnett a p Minore o uguale a 0,05. L'analisi dei componenti principali (PCA) è stata eseguita su JMP Pro (versione 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) per i composti fenolici estratti dalla buccia e dai semi dell'uva muscadina. 3. Risultati e discussione 3.1. Polifenoli estratti mediante NDES dalle bucce dell'uva moscato Nove NDES e il 75 percento di etanolo sono stati utilizzati per l'estrazione dei polifenoli dalle bucce dell'uva moscato. La tabella 2 mostra la resa di estrazione di acido ellagico, acido gallico, acido ferulico, miricetina, quercetina, kaempferol, catechina ed epicatechina. L'acido ellagico era il polifenolo estraibile più abbondante nella buccia dell'uva, seguito rispettivamente dall'acido gallico e dall'acido ferulico. Questo risultato era coerente con studi precedenti [17,18]. Le NDES n. 1, n. 8, n. 7, n. 3, n. 2 e n. 9 hanno estratto quantità significativamente maggiori di acido ellagico nella buccia dell'uva rispetto al 75 percento di etanolo. La più alta resa di estrazione di acido ellagico è stata raggiunta da NDES n. 1 seguito da NDES n. 8 rispettivamente a 22,1 ± 2,2 mg/g e 21,3 ± 2,5 mg/g (Tabella 2). Tuttavia, non c'era alcuna differenza significativa tra NDES #1 e NDES #8 secondo il test t di Student. È interessante notare che l'NDES n. 1 è risultato essere l'NDES meno efficace da cui estrarre gli antociani

sansa di mirtillo rosso [14]. Ciò ha suggerito che NDES #1 può estrarre selettivamente acido ellagico o ellagitannini dalla matrice alimentare che contiene anche antocianidine. Tale selettività può essere attribuita a differenze nelle interazioni molecolari tra le NDES e specifiche classi fenoliche. La figura S1 (riquadro A) mostra il cromatogramma HPLC di acido gallico, acido ellagico e acido ferulico estratti dalla buccia dell'uva mediante NDES #1 e rilevati a 260 nm. L'etanolo al 75 percento ha estratto 12,7 ± 1,2 mg di acido ellagico per grammo di buccia d'uva. La resa di estrazione più bassa di acido ellagico è stata osservata in NDES #4 a 7,44 ± 0,6 mg/g. La resa di estrazione dell'acido gallico mediante NDES n. 9, n. 8, n. 1, n. 4, n. 7 e n. 3 era comparabile e significativamente superiore al 75 percento di etanolo. La quantità più alta di acido gallico è stata estratta da NDES #9 a 10,4 ± 0,5 mg/g, mentre la quantità più bassa di 5,55 ± {{40}} .1 mg/g è stato estratto mediante NDES #5. La quantità più alta di acido ferulico è stata estratta da NDES n. 1 a 6,32 ± 0,7 mg/g e la quantità più bassa è stata estratta da NDES n. 5 a 3,11 ± 0.{{5{{52 }}}} mg/g. Inoltre, non vi era alcuna differenza significativa tra NDES n. 1 e il 75 percento di etanolo nell'estrazione dell'acido ferulico (Tabella 2). La quantità più alta di catechina ed epicatechina è stata estratta da NDES #3 a 0,61 ± 0,1 mg/g e 0,89 ± 0,1 mg/ g, rispettivamente (Tabella 2). Nel frattempo, NDES n. 3 e n. 6 hanno estratto quantità significativamente maggiori di epicatechina rispetto al 75 percento di etanolo. La figura S2 (riquadro A) mostra il cromatogramma HPLC di catechina ed epicatechina estratte da NDES #3 dalla buccia dell'uva. Tuttavia, la catechina non è stata rilevata nell'estratto di etanolo al 75%. Le quantità più basse di catechina (0.{88}}2 mg/g) ed epicatechina ({{90}}.14 mg/g) sono state estratte da NDES #2 e NDES # 5, rispettivamente. La miricetina era il flavonolo più abbondante e il kaempferolo era il minimo. Il test di Dunnett ha rivelato che le NDE e il 75% di etanolo erano comparabili nell'estrazione di miricetina, quercetina e kaempferolo (Tabella 2). La quantità più alta di miricetina è stata estratta da NDES n. 1 (1,84 mg/g), seguito da etanolo al 75 percento (1,73 mg/g) e quindi da NDES n. 8 (1,67 mg/g). La quantità più alta di quercetina è stata estratta con etanolo al 75% (0,41 mg/g), NDES n. 1 (0,40 mg/g) e NDES n. 8 ({ {143}}.38 mg/g). Al contrario, le quantità più basse di miricetina e quercetina sono state estratte da NDES n. 5 a 0,87 mg/g e 0,27 mg/g, rispettivamente. Questa scoperta sottolinea ulteriormente una debole capacità complessiva di NDES #5 di estrarre i polifenoli dalla buccia dell'uva. La quantità più alta di kaempferolo è stata estratta con etanolo al 75% (0.05 mg/g) e la quantità più bassa è stata estratta da NDES #5 e NDES#6 (0,03 mg/g). La figura S1 (riquadro B) mostra il cromatogramma HPLC di miricetina, quercetina e kaempferolo estratti dalla buccia dell'uva mediante NDES n. 1 rilevato a 360 nm. La somma più alta di acidi fenolici, flavonoli e flavan-3-oli è stata 40,7 mg/g estratti con NDES n. 1 seguito da 39,8 mg/g estratti con NDES n. 8, mentre la somma più bassa è stata 18,4 mg/g estratti da NDES #5 (Tabella 2). Il pH delle NDES variava tra 0,3 e 3,3 (Tabella 1). La correlazione Rsquared tra il pH delle NDE e le rese di acidi fenolici, flavonoli e flavan-3-oli è stata elencata nella Tabella 2. La mancanza di correlazione tra pH e rese di estrazione suggeriva che il pH non influisse sull'efficienza dell'estrazione. 3.2. Polifenoli estratti mediante NDES dai semi d'uva muscadina La resa complessiva di estrazione di acidi fenolici, flavonoli e flavan- 3-oli dai semi d'uva era notevolmente inferiore a quella delle bucce (Tabella 3). I polifenoli estraibili più abbondanti nei semi erano catechina ed epicatechina, mentre il kaempferolo non è stato rilevato. La complessa matrice di semi contenente olio (13 percento, p/p base secca) è una possibile spiegazione della bassa estraibilità dei composti fenolici dai semi d'uva [19]. La quantità più alta di catechina è stata estratta da NDES n. 3 a 2,77 mg/g (Tabella 3). Questa resa era significativamente superiore a tutte le altre NDES e al 75% di etanolo. La figura S2 (riquadro B) mostra il cromatogramma HPLC di catechina ed epicatechina estratte da NDES #3 dai semi d'uva. La quantità più bassa di catechina è stata estratta mediante NDES #5 a 0,30 mg/g. Tutte le NDES tranne le NDES n. 1, n. 2 e n. 9 hanno estratto quantità significativamente maggiori di epicatechina rispetto al 75 percento di etanolo (Tabella 3). Le concentrazioni più alte di epicatechina sono state estratte da NDES #4 (0,71 mg/g) e NDES #5 (0,68 mg/g), mentre la più bassa è stata estratta dal 75% di etanolo (0,11 mg/g). L'acido gallico era l'acido fenolico estraibile più abbondante nei vinaccioli, seguito rispettivamente dall'acido ferulico e dall'acido ellagico. La quantità più alta di acido gallico è stata estratta da NDES #4 a 0,45 mg/g, seguito da NDES #9 e NDES #8. Queste NDE hanno estratto quantità significativamente più elevate di acido gallico rispetto al 75% di etanolo. La quantità più bassa di acido gallico (0,2 mg/g) è stata estratta mediante NDES #3. L'estrazione più alta

la resa di acido ellagico è stata ottenuta mediante NDES #9 (0.26 mg/g) seguito da NDES #6 (0.17 mg/g), che erano significativamente superiori al 75% di etanolo. Allo stesso modo, le NDE #3 hanno estratto la quantità più bassa di acido ellagico a 0.05 mg/g. Inoltre, le NDES n. 6, n. 7 e n. 3 hanno estratto quantità significativamente maggiori di acido ferulico rispetto al 75 percento di etanolo. La resa di estrazione di acido ferulico più bassa era 0,5 mg/g secondo NDES #5. Inoltre, l'acido ferulico non è stato rilevato nell'estratto NDES #9. Ciò era probabilmente dovuto al fatto che la solubilità dell'acido ferulico era inferiore nelle NDES n. 9 rispetto ad altre NDE. L'estratto di miricetina più alto è stato ottenuto con il 75% di etanolo e NDES #7 a 0,18 mg/g, che erano superiori a tutte le NDE. La resa più alta di estrazione della quercetina è stata di NDES #6 (0.14 mg/g) e NDES #3 (0,13 mg/g) ed entrambi gli NDES erano migliori del 75% di etanolo. Allo stesso modo, il pH delle NDE non ha influenzato la resa di estrazione, come indicato dalla bassa correlazione (R-quadrato) tra il pH delle NDE e le rese di acidi fenolici, flavonoli e flavan-3-oli elencati nella Tabella 3. 3.3 . L'analisi dei componenti principali (PCA) è stata eseguita per associare la resa di estrazione di vari composti fenolici nella buccia e nei semi dell'uva con NDE e 75% di etanolo (Fig. 1). La PCA è stata eseguita su una matrice di correlazione per rilevare una possibile selettività di alcune NDE verso l'estrazione di specifici composti o gruppi fenolici. Circa l'85% della varianza dei dati cutanei è stata spiegata dai componenti principali 1 e 2. Il diagramma di carico (Fig. 1B) mostra un'elevata correlazione tra acidi fenolici (acido ellagico, acido gallico, acido ferulico) e flavonoli (miricetina, quercetina, e kaempferol). Per estrarre questi gruppi, i migliori solventi sono NDES n. 1, n. 8, n. 7 e il 75 percento di etanolo, come mostrato nel grafico del punteggio (Fig. 1A). Nel frattempo, la catechina e l'epicatechina apparivano separate dal resto dei gruppi fenolici. Come mostrato in Fig. 1A, NDES n. 3 era selettivo per estrarre catechina ed epicatechina dalle bucce dell'uva. Questa è stata un'osservazione interessante perché NDES#3 era tra le NDES meno efficaci per estrarre le proantocianidine, che sono oligomeri e polimeri di catechina ed epicatechina [14]. Ciò ha suggerito che l'NDES #3 potrebbe essere selettivo per le proantocianidine di dimensioni molecolari più piccole. Il raggruppamento di composti fenolici sulla trama di carico della buccia (Fig. 1B) era diverso dal seme (Fig. 1D) indipendentemente dalle basse rese di questi composti nei semi d'uva. Il primo e il secondo componente principale spiegavano circa il 73% della varianza dei dati sui semi. Quercetina, miricetina e acido ferulico sono stati estratti in modo più efficiente da NDES n. 6, n. 7 e etanolo al 75 percento, come mostrato nel grafico del punteggio (Fig. 1C). L'acido ellagico e l'acido gallico sono stati estratti in modo più efficace da NDES #9. Ancora una volta, la catechina è stata estratta con la massima efficienza da NDES #3, che era simile a quella osservata con le bucce. L'epicatechina è stata estratta con maggiore efficienza da NDES #5, #4 e NDES #8.

3.4. L'ottimizzazione dell'estrazione di acidi fenolici e flavonoli da bucce d'uva muscadine e modelli predittivi ANN Cloruro di colina: acido levulinico: glicole etilenico 1:1:2 (NDES #1) ha mostrato la resa di estrazione più alta per l'acido ellagico, ed è stato quindi scelto per un'ulteriore ottimizzazione e predizione. Per l'estrazione di acidi fenolici e flavonoli sono stati valutati gli impatti di quattro fattori, tra cui contenuto d'acqua, tempo di ultrasuoni, rapporto solido-solvente e temperatura di estrazione. Inoltre, sono stati applicati quattro livelli per ciascun fattore di estrazione in un totale di 4{121}} esecuzioni randomizzate. La resa sperimentale dell'estrazione di acido ellagico, acido gallico, acido ferulico, miricetina e quercetina, insieme alla somma di questi cinque, è mostrata nella Tabella 4. Nel complesso, l'intervallo della differenza della resa di estrazione tra il minimo e il massimo era relativamente ampio per gli acidi fenolici. Ad esempio, la resa più bassa per l'acido ellagico era 9.03 mg/g (serie n. 17) e la più alta era 25,3 mg/g (serie n. 15), con una differenza di 16,2 mg/g (corri #17). Inoltre, la somma più bassa della resa è stata di 20,7 mg/g e la più alta è stata di 71,5 mg/g. Questo illustra gli impatti significativi dei diversi livelli di ciascun fattore di estrazione sulla resa di estrazione. La corsa n. 15 ha estratto la più alta quantità di acido ellagico. La condizione di estrazione della corsa n. 15 era di 45 ml/10{{130}} ml di contenuto d'acqua, 25 min di ultrasuoni, rapporto solido-solvente 1:10 (g: ml) e temperatura di estrazione di 60 ◦C. La Figura S3 mostra il cromatogramma HPLC degli acidi fenolici ottimizzati estratti dalla buccia dell'uva mediante NDES n. 1 (prova n. 15 nella Tabella 4). L'acido gallico più alto (18,7 mg/g) è stato ottenuto utilizzando le condizioni di estrazione nella corsa n. 24 e il minimo è stato di 6,63 mg/g utilizzando la corsa n. 40. Per l'acido ferulico, la corsa n. 22 ha estratto la quantità più alta a 19,2 mg/g, mentre nelle prove n. 14, n. 17, n. 29 e n. 34 non è stato rilevato acido ferulico. La corsa n. 22 è stata estratta con 60 mL/100 mL di contenuto d'acqua, 5 minuti di ultrasuoni, 1:5 per il rapporto solido-solvente e una temperatura di estrazione di 60 °C. La corsa n. 2 ha estratto la miricetina più alta (10,1 mg/g) e la quercetina (1,87 mg/g). Le condizioni di estrazione della corsa n. 2 erano 60 ml/100 ml di contenuto d'acqua, 35 minuti di ultrasuoni, 1:20 per rapporto solido-solvente e temperatura di estrazione di 60 ◦C. La resa più bassa della mia certa (3,79 mg/g) è stata estratta dalla corsa n. 40. I diagrammi di contorno in Fig. 2 dimostrano l'effetto dei parametri di estrazione (X1, X2, X3 e X4) sulla resa prevista di acido ellagico estratto da NDES #1 dalla buccia dell'uva. Le rese previste di acido ellagico nella Tabella 4 sono state utilizzate per costruire questi grafici di conteggio. Ciascun pannello illustra l'impatto di 2 parametri di estrazione. Le linee di contorno sono etichettate con la resa di acido ellagico (mg/g). Il contenuto d'acqua ottimale previsto era di circa 35–45 ml/100 ml NDES, come mostrato in Fig. 2B e 2C. Un tempo di ultrasuoni più lungo ha aumentato la resa di acido ellagico (Fig. 2D e 2E), indicando un ruolo critico della sonicazione nell'estrazione NDES. Durante l'estrazione, la miscelazione di bucce o semi d'uva con NDES ha introdotto particelle e gas, che hanno aggiunto siti di cavitazione acustica per gli ultrasuoni per generare numerose piccole bolle nelle NDES. L'implosione di queste bolle ha portato a temperature estreme, differenziale di pressione, elevata forza di taglio, macroturbolenze e micro-miscelazione, che hanno effettivamente agitato le NDES per accelerare la diffusione e il trasferimento della massa. Quando le bolle di cavitazione sono implose sulla superficie dei semi d'uva o delle particelle di buccia, i microgetti risultanti e le collisioni tra le particelle hanno portato a desquamazione della superficie, erosione, rottura delle particelle, sonoporazione e distruzione cellulare [20]. Tutti questi effetti meccanici della cavitazione indotta dagli ultrasuoni hanno intensificato la penetrazione delle NDE all'interno della cellula in modo che i fenoli intercellulari dalla matrice alimentare fossero trasferiti in solventi. Il rapporto ottimale tra solido e solvente era 1:10, come indicato in Fig. 2B, 2D e 2F. Infine, temperature di estrazione più elevate fino a 60 ◦C sembrano avere un effetto positivo sull'estraibilità dell'acido ellagico, come mostrato in Fig. 2C, 2E e 2F. Ciò suggerisce una relazione diretta tra la temperatura di estrazione e la resa di acido ellagico estratto dalla buccia dell'uva. I rendimenti dell'estrazione dell'acido ellagico (Tabella 4) sono stati analizzati per la modellazione predittiva utilizzando la rete neurale artificiale. I dati sperimentali sono stati suddivisi casualmente in un set di addestramento e un set di convalida. Il motivo per includere una convalida impostata dal software statistico è sopprimere l'overfitting. Per prevedere la resa di acido ellagico (Y), sono stati valutati gli stessi quattro fattori di estrazione indipendenti (X1, X2, X3 e X4), 1–2 strati nascosti con un diverso numero di neuroni e tre funzioni di attivazione. Le funzioni di attivazione applicate erano tangenti iperboliche, lineari e gaussiane. Successivamente, i set di dati sono stati addestrati fino al raggiungimento di un valore R quadrato elevato sia per l'addestramento che per la convalida. Sono stati generati i dati di previsione e un modello. La migliore struttura ANN è stata scelta analizzando i quattro input (X1, X2, X3 e X4) con uno strato nascosto utilizzando la funzione gaussiana con dieci neuroni (Figura S5). L'R-quadrato dei set di addestramento e convalida era 0,99, mentre RASE e AAE del modello erano rispettivamente 0,062 e 0,044. L'R-quadrato della convalida ANN dell'acido ellagico in questo studio (0,99) era superiore alla convalida ANN delle procianidine (0,95) e degli antociani (0,91) in uno studio precedente [14]. Tuttavia, questo aumento di R2 può essere attribuito all'adattamento del modello meglio generato dei dati in questo studio, che potrebbe essere dovuto ai minori errori sperimentali. I modelli ANN predittivi per l'estrazione di acido ellagico utilizzando NDES #1 sono stati mostrati come equazione 3-13:

Cistanche per migliorare l'immunità

Conclusione

I risultati attuali hanno presentato ulteriori prove sull'efficacia delle capacità delle NDES di estrarre i polifenoli dai sottoprodotti dell'industria alimentare. I risultati hanno supportato l'ipotesi di un'estrazione assistita da ultrasuoni di NDES superiore al 75% di etanolo. NDES ha estratto efficacemente tre acidi fenolici, due flavonoli e tre flavan-3-oli da bucce e semi d'uva. L'NDES n. 1 era l'NDES più efficace per estrarre l'acido ellagico, mentre l'NDES n. 3 era particolarmente selettivo nell'estrazione di catechina ed epicatechina. Un notevole svantaggio delle NDES è la loro alta viscosità, che presenta sfide durante la manipolazione e il recupero. Nel presente studio, la rete neurale artificiale, indipendentemente dai suoi limiti di esito, ha dimostrato un approccio pratico per la modellazione predittiva. Le NDE sono mezzi robusti per recuperare sostanze fitochimiche dai sistemi alimentari. Alcune NDE presentano anche un solvente meno tossico per studiare questi fitochimici nelle cellule viventi [21,22]. Infine, i solventi eutettici profondi naturali sono efficaci mezzi di estrazione alternativi ai solventi organici.

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