Variazione nell'espressione genica tra due linee di sorgo bicolore che differiscono nella risposta immunitaria innata

Astratto:

L'immunità attivata dal modello molecolare associato ai microbi (MAMP) (MTI) è un componente chiave della risposta immunitaria innata della pianta al riconoscimento microbico. Tuttavia, la maggior parte della nostra attuale conoscenza di MTI proviene da piante modello (ad esempio, Arabidopsis thaliana) con relativamente meno lavoro svolto utilizzando piante coltivate. In questo lavoro, abbiamo studiato il burst ossidativo (ROS) innescato da MAMP e la risposta trascrizionale in due genotipi di sorgo bicolore, BTx623 e SC155-14E. SC155-14E è una linea che mostra un'elevata resistenza all'antracnosi e la linea BTx623 è suscettibile all'antracnosi. I nostri risultati hanno rivelato una chiara variazione nell'espressione genica e nei ROS in risposta alla flagellina (flg22) o all'eccitazione della chitina tra le due linee. Mentre la risposta trascrizionale a ciascun MAMP e in ciascuna linea era unica, c'era un notevole grado di sovrapposizione e siamo stati in grado di definire un insieme centrale di geni associati alla risposta trascrizionale MAMP del sorgo. Il termine GO e l'analisi dell'arricchimento del percorso KEGG hanno scoperto più DEG correlati all'immunità e alla resistenza ai patogeni nei campioni SC155-14E trattati con MAMP rispetto a BTx623 con lo stesso trattamento. I risultati forniscono una base per studi futuri per studiare i percorsi dell'immunità innata nel sorgo, compresi gli sforzi per migliorare la resistenza alle malattie.

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Parole chiave:

sorgo bicolore; ROS; immunità innata; MAMP; RNA-seq; espressione genica

1. Introduzione

Le piante sono naturalmente esposte a una varietà di stress, inclusi numerosi agenti patogeni batterici, fungini e virali [1]. Le piante si proteggono dagli agenti patogeni utilizzando strutture e sostanze chimiche preformate e risposte del sistema immunitario indotte dalle infezioni. Il sistema immunitario delle piante impiega un sistema di percezione a due livelli con due strati interconnessi di recettori.

Il primo livello è attivato da recettori di riconoscimento di pattern localizzati in superficie (PRR), che rilevano le molecole all'esterno della cellula riconoscendo l'agente patogeno invasore attraverso il rilevamento di motivi strutturali conservati, chiamati Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMPs), che innescano un moderato, ma ampia, risposta difensiva [2]. Flagellina, chitina, lipopolisaccaridi, peptidoglicani (PGN) e fattore di allungamento Tu sono esempi di MAMP ben studiati [3-5]. Questa risposta di difesa è chiamata immunità innescata da MAMP (MTI) [6]. Il secondo livello di difesa noto come immunità attivata dall'effettore (ETI) si verifica in risposta a specifiche proteine ​​effettrici derivate da agenti patogeni che vengono riconosciute dalla pianta attraverso l'azione delle proteine ​​di resistenza, risultando in una risposta immunitaria forte, ma altamente specifica. L'ETI può spesso essere riconosciuto dall'induzione della morte cellulare localizzata definita risposta ipersensibile (HR) [7]. Entrambi i sistemi MTI ed ETI rilevano i patogeni e rispondono attivando le difese antimicrobiche nella cellula infetta e nelle cellule vicine [3,8]. Le piante portano anche recettori immunitari che riconoscono effettori patogeni altamente variabili, questi includono la classe di proteine ​​NBS-LRR [9].

Inoltre, la resistenza sistemica acquisita (SAR) è una risposta di resistenza "dell'intera pianta" che si verifica a seguito di una precedente esposizione localizzata a un agente patogeno. Il SAR è associato all'induzione di un'ampia gamma di geni (geni correlati alla patogenesi) e l'attivazione del SAR richiede l'accumulo di acido salicilico endogeno (SA) [10].

Studi condotti principalmente utilizzando Arabidopsis hanno dimostrato che l'MTI può causare una varietà di risposte tra cui cambiamenti nella produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), produzione di specie reattive dell'azoto come l'ossido nitrico (NO), deposizione di callosio, livelli di calcio intracellulare, flusso di ioni attraverso il plasma membrana, induzione o repressione dell'espressione di diversi geni correlati alla difesa delle piante, alterazioni nella parete cellulare delle piante, induzione di composti antimicrobici e sintesi di proteine ​​​​correlate alla patogenesi (PR) [3,11].

Sebbene molte di queste risposte MTI possano essere considerate risposte generali delle piante, la loro entità può essere specifica per specie di pianta e persino specifica per cultivar [12-17]. Sono stati sviluppati metodi per quantificare la risposta MTI delle piante. Questi metodi includono la misurazione della produzione di ROS o NO, la fosforilazione della protein chinasi attivata dal mitogeno, l'espressione genica specifica indotta da MAMP, l'inibizione della crescita della piantina, la lignina e i fenoli legati alla parete cellulare e la resistenza indotta da MAMP ai patogeni batterici e fungini [18-20].

Il sorgo bicolore (L.) Moench è una coltura cerealicola globale chiave che è stata adattata a una vasta gamma di habitat e allevata per scopi diversi [21]. Si prevede che la coltivazione del sorgo aumenterà sostanzialmente in tutto il mondo come una delle principali colture per la produzione di cibo e biomassa [22].

Con l'aumentare delle pratiche e delle aree geografiche di coltivazione del sorgo, è inevitabile che aumenti la pressione della malattia. Il sorgo si distingue dagli altri cereali per la sua gamma insolitamente ampia di malattie, che è uno dei vincoli più importanti alla sua produzione. A livello globale, le malattie fungine diffuse sono le malattie del sorgo più distruttive che comportano enormi perdite di resa, sia in termini di quantità che di qualità dei chicchi [23]. L'antracnosi è una delle più gravi malattie fungine che colpiscono la resa in granella di sorgo e la produzione di biomassa. Le perdite di resa dovute a questo patogeno possono essere dal 50 al 70 percento nelle cultivar sensibili [24,25]. Le piante hanno sviluppato varie strategie di difesa per combattere l'invasione di agenti patogeni. Nel sorgo, queste strategie includono l'attivazione delle proteine ​​PR [26], l'accumulo di perossido di idrogeno [27] e la biosintesi delle fitoalessine flavonoidi [28]. Diversi approcci sono stati usati per studiare le risposte di resistenza del sorgo, identificare i composti di difesa e identificare le barriere fisiche contro l'antracnosi (vedi riferimento [29,30] per la revisione). Gli studi sull'espressione genica sono stati ampiamente utilizzati per identificare i geni di resistenza candidati nelle piante sulla base dell'espressione differenziale tra cultivar resistenti e suscettibili o piante non inoculate e piante inoculate da agenti patogeni (ad esempio, riferimenti [31-37]). Wang et al., [37] hanno eseguito analisi trascrittomiche per studiare la risposta della cultivar di sorgo BTx623 a C. subline-ola. Hanno riferito che i geni coinvolti nel metabolismo dei fenilpropanoidi e la biosintesi dei metaboliti secondari sono stati identificati come espressi in modo differenziato in risposta all'infezione con il patogeno rispetto alle piante di controllo non inoculate.

Tuttavia, questi esperimenti sono stati condotti con piantine della cultivar suscettibile BTx623. Ulteriori studi trascrittomici per confrontare la risposta dell'espressione genica a un agente patogeno nelle cultivar di sorgo sensibili e resistenti sarebbero utili. Pertanto, è importante comprendere l'architettura genetica che controlla la resistenza alle malattie basali del sorgo e la sua connessione con la resistenza quantitativa alle malattie.

Come primo passo in questa direzione, abbiamo recentemente esaminato una serie di diversi germoplasmi di sorgo per la variazione nella loro risposta all'eccitazione di flg22 e chitina, nonché per la resistenza alle malattie fungine [38]. In questo caso, l'MTI è stato quantificato misurando la produzione di ROS su elicitazione di MAMP. Tra i risultati di questo studio precedente c'era l'identificazione di genotipi di sorgo che mostravano una risposta forte o debole all'attivazione di MAMP.

Il sequenziamento ad alto rendimento di nuova generazione e lo studio dei trascrittomi possono aiutare a chiarire le risposte alle infezioni fungine nelle piante e aumentare la comprensione delle risposte dell'ospite. Le analisi del trascrittoma sono state ampiamente utilizzate per studiare le risposte delle piante alle infezioni fungine in molte specie di piante, comprese le colture di cereali (ad esempio, riferimenti [31-37]).

Tuttavia, i dati pubblicati sull'analisi comparativa del trascrittoma delle colture di cereali si sono concentrati principalmente sulla risposta a vari agenti patogeni. Nel sorgo, diverse pubblicazioni si sono concentrate sui confronti del trascrittoma di piante trattate con vari agenti patogeni, tra cui l'antracnosi [35,37]. Alcune pubblicazioni precedenti hanno suggerito che non esiste una correlazione significativa tra la risposta ai MAMP e la malattia fungina. Ad esempio, Zhang et al. [17] hanno riportato una forte correlazione tra la risposta a due MAMP flg22 e la chitina in una popolazione di mappatura del mais, ma nessuna corrispondenza con la risposta alla malattia fungina. Kimball et al. [38] hanno anche riportato una bassa correlazione tra i punteggi di risposta ROS indotta da flg22- e i punteggi di resistenza alla macchia fogliare target in due popolazioni RIL di sorgo inclusa una popolazione BTx623/SC155-14E. Pertanto, data la scarsità di dati, abbiamo ritenuto importante profilare trascrizionalmente la risposta del sorgo ai trattamenti MAMP.

In questo rapporto attuale, estendiamo la nostra analisi precedente misurando la risposta trascrizionale globale all'elicitazione di MAMP. Abbiamo utilizzato l'analisi del sequenziamento dell'RNA basata su Illumina per esaminare i cambiamenti trascrizionali in risposta al trattamento con flg22 o con chitina nei genotipi di sorgo BTx623 e SC155-14E, che in precedenza avevamo caratterizzato rispettivamente come responder MTI deboli e forti, rispettivamente. BTx623 è la linea di riferimento del genoma di Sorghum bicolor [22] e SC155-14E è una linea che mostra un'elevata resistenza all'antracnosi [39]. Patile et al. [39] hanno riferito che SC155-14E ha mostrato un alto livello di resistenza stabile (quasi esente da malattia) alla malattia da antracnosi in tutti gli ambienti testati, mentre BTx623 è suscettibile a questa malattia fungina. La nostra analisi RNA-seq ha identificato 5252 e 8085 geni espressi in modo differenziale (DEG) in BTx623 trattato con flg22 e chitina, rispettivamente, e 3849 e 5786 DEG in flg22 e SC 155-14E trattati con chitina, rispettivamente, rispetto ai controlli fittizi non trattati di questi due genotipi.

Inoltre, un confronto tra DEG selezionati utilizzando due diverse pipeline bioinformatiche ha mostrato risultati molto simili. I profili di espressione dei geni differenzialmente espressi, l'analisi dell'arricchimento dell'ontologia genica (GO) e l'analisi dell'arricchimento del percorso KEGG hanno mostrato una chiara variazione basata sul genotipo nell'espressione genica correlata a MTI. Il termine GO e i risultati dell'arricchimento del percorso KEGG hanno rivelato più DEG correlati all'immunità e alla resistenza ai patogeni (geni PR, risposta genica alla chitina, risposta genica all'acido salicilico, risposta genica allo stress, ecc.) presentati in SC trattata con MAMP{{4} }E campioni relativi a BTx623 trattato con MAMP. I risultati forniscono una linea di base per identificare i vari componenti della risposta MTI del sorgo.

2. Risultati e discussione

2.1. Variazione del burst ossidativo in diverse foglie di sorgo

La nostra precedente analisi della risposta MTI di diversi genotipi di sorgo ha rivelato una variazione significativa nel burst ossidativo innescato da MAMP tra i genotipi BTx623 e SC155-14E [38]. Inoltre, SC155-14E è una linea che mostra un'elevata resistenza all'antracnosi, mentre la linea BTx623 è suscettibile all'antracnosi [39]. È stato per questi motivi che questi due genotipi sono stati scelti per il confronto utilizzando RNA-seq.

Durante le precedenti misurazioni del ROS, abbiamo riscontrato una variazione significativa anche all'interno della stessa pianta, il che ci ha portato a indagare più attentamente sulla fonte di questa variazione. Nello specifico, abbiamo testato la produzione di ROS utilizzando tre set di foglie, andando dal basso verso l'alto di piante BTx623 e SC155-14E di quindici giorni. Le foglie sono state contrassegnate come n. 1, n. 2 e n. 3, dal basso verso l'alto, come mostrato nella Figura 1A. I risultati del test ROS (Figura 1B) hanno rivelato che: (1) il livello di produzione di ROS era inferiore nelle foglie più vecchie (foglia n. 1), mentre i livelli più alti di produzione di ROS in risposta a flg22 o chitina provenivano dalle foglie più giovani ( foglia #3). (2) Sia le foglie BTx623 2 trattate con MAMP che quelle non trattate e le foglie più giovani (foglia n. 2) hanno prodotto livelli relativamente bassi di produzione di ROS.

Al contrario, le seconde foglie più giovani di SC155-14E trattate con MAMP hanno prodotto livelli significativamente (a livello 0.01) di produzione di ROS più elevati rispetto al mock non trattato, così come al mock trattato o al mock di BTx{ {5}}e foglie più giovani. (3) L'esplosione ossidativa innescata dalle applicazioni di flg22, o chitina, è stata rilevata nei dischi fogliari delle foglie più giovani (foglia n. 3) di entrambi i genotipi, sebbene, come osservato in precedenza, i livelli di produzione di ROS fossero più elevati nelle SC trattate con MAMP 155-14E relativo a BTx623. L'andamento temporale della produzione di ROS innescata da flg22-e chitina in SC155-14E 2a foglia più giovane ha rivelato che la produzione di ROS innescata da chitina si è verificata prima della produzione di ROS innescata da flg22- (Figura 1C ). Risultati simili sono stati riportati da Zhang et al. [17] dove la produzione di ROS innescata dalla chitina è apparsa prima della produzione di ROS innescata da flg22-in flg22 e nelle piantine di mais trattate con chitina. È stato riportato [40] che la produzione di ROS in risposta a flg22 ha mostrato la più alta produzione di ROS intorno a 12 min, ed era la più bassa a 30 min in Arabidopsis. I nostri risultati del test ROS nel sorgo hanno mostrato la più alta produzione di ROS intorno a 13 minuti e la più bassa a 30 minuti dopo il trattamento con flg22, che è molto simile ai risultati in Arabidopsis. Poiché il nostro obiettivo era trovare le condizioni ottimali per il confronto della risposta MTI dei due genotipi, abbiamo scelto le seconde foglie più giovani di 15-piante di un giorno per l'estrazione dell'RNA e la successiva analisi trascrittomica. La variazione tra le foglie delle singole piante di sorgo ricorda che i risultati possono variare tra gli esperimenti a seconda della fonte, dei tempi e di altre caratteristiche di un dato esperimento e, quindi, che i parametri sperimentali devono essere attentamente controllati.

Il burst ossidativo, una produzione rapida e transitoria di specie reattive dell'ossigeno (ROS), è uno dei primi aspetti osservabili della risposta di difesa di una pianta [41]. Considerando che il burst di ROS è una risposta immediata, ci si aspetta una risposta trascrizionale leggermente successiva dei geni correlati all'MTI. Abbiamo raccolto campioni 60 minuti dopo il trattamento con MAMP per l'analisi RNA-Seq.

2.2. Geni differenzialmente espressi (DEG) di BTx623 e SC155-14E in risposta ai trattamenti MAMP

Per valutare il livello di espressione dei geni codificanti proteine ​​​​di sorgo bicolore annotati per ciascun campione, il numero di letture pulite di RNA-seq mappato su ciascun gene è stato calcolato e quindi normalizzato in FPKM (frammenti per modello di esone kb per milione frammenti mappati). Sono stati studiati i cambiamenti di espressione di ciascun gene nei dischi fogliari trattati con MAMP di BTx623 e SC155-14E rispetto ai trattamenti fittizi (acqua). I geni espressi totali erano simili in tutti i trattamenti di entrambi i genotipi: 27.171, 27.283, 27.161, 27.182, 27.512 e 27.175 geni espressi in mock of BTx623, flg22-trattato BTx623, chitina-trattato BTx623, mock of SC{ {22}}E, flg22-trattato SC155-14E e SC trattato con chitina155-14E, rispettivamente. Abbiamo utilizzato il genoma di riferimento BTx623 per la mappatura in lettura in entrambe le righe poiché il riferimento specifico per SC155-14E non è disponibile. I numeri dei geni espressi recuperati da BTx623 e SC{{30}}E con tutte le condizioni di cui sopra hanno rivelato che entrambe le linee condividevano numeri simili di geni espressi. Le percentuali complessive di mappatura delle letture dei campioni di SC155- 14E mock (3 repliche), SC155-14E trattate con flg22 (3 repliche), SC155-14E trattate con chitina (3 repliche) , BTx623 mock (3 replicati), BTx623 trattato con flg22 (3 replicati), BTx623 trattato con chitina (3 replicati) sono stati: 93,6 percento , 93,9 percento , 93,9 percento , 93,8 percento , 93,9 percento , 93,6 percento , 93,5 percento , 93,5 percento , 93,1 percento , 96,9 percento , 97,0 percento , 97,0 percento , 97,2 percento , 96,8 percento , 97,0 percento , 96,9 percento , 97,0 percento , 97,0 percento , rispettivamente. Questi risultati hanno suggerito che i diversi effetti del trattamento con MAMP sui trascrittomi di BTx623 e SC155-14E non erano dovuti alle differenze di sequenza genomica tra i due genotipi

Il grafico PCA dell'espressione genica fornisce informazioni sull'associazione tra i campioni. Per esplorare la somiglianza dei nostri campioni, abbiamo eseguito l'analisi PCA. Il tracciato del campione su PC1 e PC2 (Figura 2) ha mostrato che quattro condizioni sperimentali (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_chitina e SC{ {10}}E_chitin) erano ampiamente separati. Al contrario, le tre repliche biologiche di ciascuna linea di sorgo e ciascun trattamento MAMP, così come il trattamento fittizio, erano strettamente raggruppate insieme, rispettivamente, indicando una buona riproducibilità tra repliche biologiche (Figura 2).

I grafici del vulcano nella Figura 3 mostrano l'espressione genica nelle due linee di sorgo trattate con flg22 o chitina. Un grafico del vulcano è un tipo di grafico a dispersione che mostra la significatività statistica (valore p) rispetto all'entità del cambiamento (cambiamento di piega). Consente una rapida identificazione visiva dei geni con cambiamenti di grandi dimensioni che sono anche statisticamente significativi. Questi possono essere i geni biologicamente più significativi. Nella Figura 3, i geni con −log10 (valore p) uguale o maggiore di 3 sono considerati DEG. I punti di colore rosso rappresentano i DEG e i punti di colore nero rappresentano i non-DEG. In ogni grafico, i geni con log2 (fold_change) maggiore di 0 sono geni up-regolati, altrimenti geni down-regolati. I geni più sovraregolati sono verso destra, i geni più sottoregolati sono verso sinistra e i geni più statisticamente significativi sono verso l'alto.

I geni espressi in modo differenziale (DEG) sono stati selezionati da ciascun trattamento in base al loro significato di espressione (valore p 0.001). Va notato che abbiamo utilizzato un valore p di 0.001 come soglia ma non FDR (valori q) per selezionare i DEG in questo rapporto. Anche i FDR (valori q) erano significativi a questo livello (tabelle S2-S5). Con un valore p di 0.001, i FDR erano 0,0039, 0,0051, 0,0025 e 0,0035 per BTx623 con trattamento flg22, SC155-14E con trattamento flg22, BTx623 con trattamento con chitina e SC{{ 26}}E con trattamento con chitina, rispettivamente. I valori p e q dei geni di BTx623 e SC155-14E in tutte le condizioni sono elencati nelle tabelle S2-S5. Analizzando i modelli di espressione di questi geni nelle foglie trattate con MAMP di BTx623 e SC155-14E, abbiamo osservato un gran numero di geni (14-30 percento dei geni espressi totali) che mostravano grandi differenze dopo flg22 o chitina trattamento in entrambe le linee di sorgo. Il numero di DEG totali di BTx623 trattato con chitina (8085) era molto vicino a quello riportato in un precedente studio del trascrittoma in BTx623 infettato dal patogeno dell'antracnosi C. subline-ola (8078) [37]. Il numero di DEG era più alto nelle foglie BTx623 trattate con flg22 (19%) o chitina (30%) rispetto a SC155-14E (rispettivamente 14% e 21%).

Sebbene il numero più elevato di DEG nel BTx623 trattato con MAMP rispetto a SC155-14E fosse opposto alla risposta ROS di questi due genotipi, questo forse non è sorprendente poiché la risposta ROS e la risposta dell'espressione genica al trattamento con MAMP si verificano a tempi diversi, sono ampiamente indipendenti e sono mediati da meccanismi diversi [42,43]. Il termine GO e l'arricchimento del percorso KEGG hanno rivelato più DEG correlati all'immunità e alla resistenza ai patogeni presentati nei campioni SC155-14E trattati con MAMP. Inoltre, il fatto che i numeri di DEG fossero più alti nei campioni trattati con chitina rispetto a quelli trattati con flg22 corrispondeva bene ai test di risposta ROS (Figura 1B) in cui abbiamo visto una risposta ROS più forte al trattamento con chitina.

Per studiare fino a che punto i geni e i processi biologici sono condivisi tra i trattamenti flg22 e chitina in BTx623 e SC155-14E, abbiamo confrontato i loro DEG in modo più dettagliato. I diagrammi di Venn nella Figura 4A mostrano la sovrapposizione in DEG nel totale, il gene regolato verso l'alto e verso il basso si imposta su un valore p di 0.001. Su un totale di 10.535 DEG, un nucleo di 2272 geni ha risposto sia al trattamento con flg22 che con chitina in entrambe le linee di sorgo. Allo stesso modo, dal totale di 5410 geni up-regolati, un core set di 1778 geni è stato up-regolato in entrambi i genotipi, mentre, su un totale di 5125 geni down-regolati, un core set di 474 è stato down-regolato in entrambi i genotipi. genotipi.

I dati di RNA seq qui presentati sono stati analizzati utilizzando la pipeline di bioinformatica con gli strumenti Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 e Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) con parametri predefiniti (pipeline n. 1). Per confermare ulteriormente i risultati del test, abbiamo utilizzato un'altra pipeline (pipeline n. 2) con HiSat2, HTSeq e edgeR per eseguire l'analisi. HiSat2 è il prossimo sviluppo di TopHat2. Abbiamo confrontato i DEG di ciascuna condizione (vale a dire, due genotipi trattati con flg22 o chitina, tutti, DEG regolati verso l'alto o verso il basso) selezionati utilizzando entrambe le pipeline. I risultati (Figura 5) hanno mostrato che i numeri DEG selezionati utilizzando entrambe le pipeline erano molto vicini.

I DEG totali selezionati con la pipeline n. 1 rispetto alla pipeline n. 2 erano BTx623_flg22: 5241 rispetto a 5413; SC155-14E_flg22: 3849 contro 3476; BTx623_chitina: 8085 contro 8320; SC155-14E_chitina: 5786 vs. 5383. I DEG sovraregolati selezionati con la pipeline n. 1 rispetto alla pipeline n. 2 erano BTx623_flg22: 3074 rispetto a 3076; SC155-14E_flg22: 2591 contro 2483; BTx623_chitina: 4156 contro 4583; SC155-14E_chitina: 3486 rispetto a 3346. I DEG sottoregolati selezionati con la pipeline n. 1 rispetto alla pipeline n. 2 erano BTx623_flg22: 2152 rispetto a 2237; SC155-14E_flg22: 1257 contro 993; BTx623_chitina: 3919 contro 3757; SC155-14E_chitina: 2296 vs. 2037. Inoltre, i risultati nella Figura 5 hanno anche rivelato che un'alta percentuale di DEG selezionati utilizzando le due pipeline si sovrapponeva in tutte le condizioni. La percentuale di numeri DEG sovrapposti/numeri DEG selezionati utilizzando la pipeline n. 1 era del 79,6% e del 73,7% . 80,8% e 74,4% dei DEG totali di BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitina e SC155-14E{{73} } chitina, rispettivamente; 83 percento, 80,6 percento, 85,3 percento e 81,1 percento di DEG sovraregolati di BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitina e SC{{ 88}}E_chitina, rispettivamente; 75,1%, 59,5%, 75,8% e 67,4% dei DEG sottoregolati di BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitina e SC{{ 105}}E_chitina, rispettivamente. Pertanto, questi risultati comparativi hanno dimostrato che i dati RNA seq presentati sono corretti indipendentemente da quale dei due metodi viene utilizzato per l'analisi.

La mappa termica dei profili di espressione raggruppati dei DEG di BTx623 e SC155-14E trattati con flg22 o chitina per i tre replicati biologici è mostrata nella Figura 6. I valori di espressione genica sono stati normalizzati come punteggi z. Il colore passa dal viola al rosso all'aumentare del valore, indicando l'espressione genica da bassa ad alta. Questa heatmap mostra chiaramente la regolazione differenziale dei geni in BTx623 e SC155-14E in risposta al trattamento con flg22 o chitina. Inoltre, i risultati mostrano anche che le mappe di calore di tre repliche biologiche in ciascuna condizione erano molto vicine, indicando una buona riproducibilità tra repliche biologiche.

Inoltre, i confronti a coppie (Figura 7A) tra DEG regolati verso l'alto e verso il basso dai trattamenti flg22 e chitina hanno mostrato che c'era una grande sovrapposizione tra BTx623 e SC 155-14 E. Tra i 3074 geni flg22-indotti in BTx623, l'83,8% è stato indotto anche in BTx623 in risposta al trattamento con chitina, mentre dei 2591 geni indotti flg22-in SC155-14E, {{ Il 16}},6% ha anche risposto a SC155-14E trattato con chitina. Questo forse non è sorprendente poiché precedenti lavori su Arabidopsis thaliana hanno mostrato una significativa sovrapposizione nei geni che rispondono a una varietà di MAMP distinti, che definiscono i percorsi MTI generali [44-46].

Inoltre, Zhang et al. [17] hanno anche riportato una correlazione significativa tra flg22 e la risposta della chitina nel mais. È stata osservata una minore sovrapposizione tra i dischi fogliari BTx623 e SC155-14E trattati con lo stesso MAMP (Figura 7A). Il 64,3% dei geni indotti da flg22-in BTx623 è stato indotto in SC155-14trattato con flg22-e il 68,3% dei geni indotti da chitina in BTx623 è stato indotto in SC trattato con chitina155-14 E. Allo stesso modo, dei 2152 geni down-regolati dopo il trattamento con flg22 di BTx623, un'alta percentuale (75,9%) è stata anche down-regolata dalla chitina in BTx623. Su 1257 geni sottoregolati da flg22 in SC155-14E, il 70,8% è stato anche sottoregolato dalla chitina in SC155-14E. Tuttavia, solo il 29% dei geni flg22 sottoregolati in BTx623 era sottoregolato anche in SC155-14trattato con flg22-e il 45% dei geni sottoregolati con chitina in BTx623 era sottoregolato in SC155-14E trattato con chitina (Figura 7A). Quindi, mentre c'era una significativa convergenza nei percorsi MTI verso flg22 e chitina nei due genotipi confrontati, i dati suggeriscono anche un'interessante complessità su come questi due genotipi rispondono a diversi MAMP.

2.3. Analisi dell'arricchimento funzionale genico che confronta la risposta MTI di BTx623 e SC155-14E

Per determinare le categorie funzionali dei geni regolati in risposta a flg22 o chitina e la risposta differenziale delle due linee di sorgo testate, abbiamo utilizzato la piattaforma PlantRegMap [47,48] per eseguire l'analisi di arricchimento del set genico basata sui DEG rilevati nel biologico categoria di processo. Le Figure 8A e B mostrano i termini GO superiori dei geni arricchiti di processi biologici con DEG up-regolati e DEG down-regolati sia da BTx623 che da SC155-14E. L'elenco completo dei DEG è fornito nelle Tabelle S6–S13. Molti di questi geni sono associati a processi tra cui la risposta allo stress, le risposte di difesa delle piante, la risposta allo stimolo, la risposta allo stimolo biotico, la risposta al batterio, la risposta a un altro organismo, la comunicazione cellulare, il processo metabolico del fosforo e la fosforilazione proteica.

I risultati in Figura 8A e B mostrano chiare differenze nell'espressione di geni normalmente associati all'immunità innata tra i due genotipi di sorgo. In quei termini GO arricchiti, sono stati trovati alcuni DEG unici in ogni condizione con sovrapposizione. Ad esempio, il termine risposta di difesa GO (GO 0006952): 91 e 84 DEG sovraregolati sono stati arricchiti rispettivamente in BTx623 o SC155-14E trattati con flg22. All'interno di questi DEG, 24 DEG erano unici in BTx623 e 15 DEG sono stati trovati solo in SC155-14E, mentre gli altri erano presenti in entrambi i genotipi di sorgo. Allo stesso modo, 102 e 93 DEG sovraregolati sono stati arricchiti rispettivamente in BTx623 o SC155-14E trattati con chitina. All'interno di questi DEG, 20 DEG erano unici in BTx623 e 14 DEG erano unici in SC155-14E, mentre gli altri erano presenti in entrambi i genotipi di sorgo.

Nel termine GO di "risposta alla chitina (GO: 0010200)", abbiamo osservato 18 DEG sovraregolati su un totale di 779 geni in questa categoria arricchiti nei campioni SC 155-14E trattati con chitina (Figura 8 ), mentre nessun gene è stato arricchito nei campioni BTx623 trattati con chitina. Inoltre, 16 DEG sovraregolati sono stati arricchiti in campioni SC155-14trattati con flg22-e 12 DEG sovraregolati sono stati arricchiti in campioni BTx623 trattati con flg22-(Figura 8). Il confronto degli elenchi DEG del termine GO "risposta alla chitina" in flg22 e BTX623 trattato con chitina e SC155-14E (Tabella S9) ha rivelato che i DEG si sono arricchiti in flg22, o SC trattato con chitina155- 14 E erano gli stessi tranne che la chitina ha indotto due DEG in più rispetto a flg22. Al contrario, tutti i 12 DEG arricchiti in BTX623 trattato con flg22- erano diversi dai DEG indotti dai MAMP in SC155-14E. Quei DEG indotti dai MAMP possono contribuire alla risposta di resistenza dell'antracnosi in SC155-14E poiché la chitina è una tipica molecola MAMP delle pareti delle cellule fungine che suscita risposte immunitarie nelle piante. Stringis et al. [49] hanno anche riportato che una serie di DEG sovraregolati sono stati arricchiti nel termine GO di "risposta alla chitina" da chitina, flg22 e un rizobatterio benefico per le piante Pseudomonas simiae WCS417 piante di Arabidopsis trattate. Matic et al. [33] hanno riferito che 21 DEG sono stati arricchiti nel termine GO di "risposta alla chitina" dall'analisi RNA-seq della foglia di riso di una cultivar resistente ma non da una cultivar suscettibile dopo l'infezione con il patogeno fungino Fusarium fujikuroi.

I geni PR (Pathogenesis-related) sono coinvolti nella risposta immunitaria delle piante [50] e hanno attività antimicotica contro molti funghi fitopatogeni [51]. Le proteine ​​PR-10 sono piccole proteine ​​intracellulari, principalmente acide, con proprietà antimicotiche che sono state associate a risposte di difesa nelle specie vegetali, incluso il sorgo [52]. I membri della famiglia del gene PR-10 sono stati indotti da attacchi di agenti patogeni in un'ampia varietà di specie vegetali [53]. Nel sorgo, Lo et al. [26] hanno riferito che l'espressione di PR-10 è stata indotta come parte della difesa attiva dell'ospite del sorgo contro i patogeni fungini fogliari C. heterostrophus e C. sublineolum. Katia et al. [54] hanno riferito che diverse cultivar di sorgo hanno mostrato una significativa induzione di quantità relative normalizzate di PR-10 dopo l'inoculazione con spore fungine di C. lunata e F. capsicum nei test sul campo. In condizioni di serra, le glume delle piante inoculate hanno mostrato l'induzione dell'mRNA PR-10 e la risposta è stata maggiore in due cultivar resistenti testate rispetto a due cultivar suscettibili.

I nostri risultati hanno rivelato che tra i DEG identificati, sono stati trovati quattro geni PR-10 (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). In SC155-14E tutti e quattro i PR-10 DEG sono stati sovraregolati da flg22 o trattamento con chitina, al contrario, in BTx623, SORBI_3001G401000 non è stato trovato in DEG e SORBI{{15} }G401300 (up-regolato) è stato presentato solo in BTx623 con trattamento chitina ma non con trattamento flg22. Ciò ha indicato che l'espressione dei geni PR potrebbe essere impiegata in risposta a livelli più elevati di prodotti ROS dopo il trattamento con MAMP e la resistenza all'antracnosi in SC155-14E.

L'acido salicilico (SA) è un segnale immunitario della pianta essenziale sia per la risposta di difesa locale che per la resistenza sistemica acquisita. Svolge un ruolo importante nella resistenza e nella difesa delle piante contro gli attacchi dei patogeni [55]. Nel sorgo, Tugizimana et al. [56] hanno riportato cambiamenti quantitativi nei livelli di acido jasmonico, coniugati di acido salicilico e acido abscissico nel sorgo infetto da C. subline-ola. C. subline-ola è l'agente causale dell'antracnosi. I genotipi di sorgo con livelli aumentati di aminoacidi (triptofano e tirosina), acido jasmonico e coniugati salicilici e zeatina erano più resistenti all'antracnosi. In questo studio, il termine GO "risposta all'acido salicilico" (GO:0009751) comprendente 19 DEG sovraregolati è stato specificatamente arricchito solo in SC155-14E trattato con chitina (Tabella S9). Pertanto, la via di segnalazione salicilica potrebbe svolgere un ruolo importante in risposta a livelli più elevati di produzione di ROS dopo il trattamento con MAMP e resistenza all'antracnosi in SC155-14E.

Inoltre, 169 DEG sovraregolati sono stati arricchiti nella risposta del termine GO allo stress esclusivamente in SC 155-14 E trattati con chitina (Tabella S9). Gli altri termini GO trovati esclusivamente in SC155-14E trattato con MAMP, ma non in BTx623 con lo stesso trattamento sono processi metabolici secondari (GO:0019748), processo di biosintesi della fosfatidilcolina (GO:0006656) e processo di biosintesi dei lipidi ( VAI:0008610).

Inoltre, 169 DEG sovraregolati sono stati arricchiti nella risposta del termine GO allo stress esclusivamente in SC 155-14 E trattati con chitina (Tabella S9). Gli altri termini GO trovati esclusivamente in SC155-14E trattato con MAMP, ma non in BTx623 con lo stesso trattamento sono processi metabolici secondari (GO:0019748), processo di biosintesi della fosfatidilcolina (GO:0006656) e processo di biosintesi dei lipidi ( VAI:0008610).

Abbiamo anche esaminato la composizione dei geni che sono co-regolati tra i due genotipi dopo il trattamento con flg22 o chitina, nonché i set principali di DEG in tutti i trattamenti e due genotipi mediante analisi di arricchimento GO (Figure 4B e 7B). L'elenco completo dei DEG è fornito nelle tabelle S14 e S15. La Figura 4B mostrava i termini GO arricchiti dei set principali dei DEG totali, regolati verso l'alto e verso il basso in BTx623 e SC155-14E con tutti i trattamenti. I termini GO relativi alla risposta dei MAMP e alla difesa delle piante (ad es., legame alla chitina, risposta di difesa, attività della chinasi proteica, fosforilazione proteica, attività della serina/treonina chinasi della proteina) sono stati significativamente arricchiti nei DEG sovraregolati mentre i termini GO del processo biosintetico del metabolita secondario, il legame dello ione ferro, l'attività dell'ossidoreduttasi sono stati arricchiti solo in DEG down-regolati. Questo risultato è stato simile ai risultati in Arabidopsis dove i termini GO relativi alla risposta agli elicitori (peptidi flg22 da P. simile WCS417 e P. aeruginosa PAO1, chitina e cellule batteriche di P. simile WCS417) sono stati arricchiti in modo più significativo nel nucleo di DEG [49].

La Figura 7B mostrava i termini GO significativamente arricchiti di insiemi di DEG co-regolati (ovvero regolati verso l'alto o verso il basso in entrambi i genotipi) tra BTx623 e SC155-14E dopo flg22 o trattamento con chitina. I risultati hanno rivelato che i termini GO correlati alla risposta dei MAMP e alla difesa delle piante (ad esempio, risposta di difesa, attività della proteina chinasi, fosforilazione della proteina, attività della proteina serina/treonina chinasi) erano arricchiti solo in DEG flg22 o chitina up-regolati in entrambi i genotipi mentre i termini GO del processo biosintetico del metabolita secondario, il legame dell'eme, il legame dello ione ferro, l'attività ossidoriduttasica di un atomo di ossigeno e il processo biosintetico della fosfatidilcolina sono stati arricchiti esclusivamente in gruppi di DEG down-regolati.

2.4. Analisi di arricchimento del percorso KEGG della risposta MTI di BTx623 e SC155-14E

La Figura 9 mostra l'analisi dell'arricchimento del percorso KEGG dei DEG sovraregolati trovati nei campioni BTx623 e SC155-14E trattati con MAMP utilizzando lo strumento online DAVID [57]. L'elenco completo dei DEG è fornito nelle Tabelle S16–S20. I risultati identificano quelle specifiche vie superiori di KEGG arricchite a seguito dell'attivazione di MTI nei due genotipi di sorgo. Nel percorso KEGG "interazione pianta-patogeno", abbiamo osservato che 24 DEG sovraregolati sono stati arricchiti nei campioni SC155-14E trattati con chitina, mentre nessuno dei DEG è stato arricchito nei campioni BTx623 trattati con chitina. La più forte risposta della chitina del genotipo SC155-14E è correlata alla maggiore resistenza di questo genotipo alla malattia fungina dell'antracnosi [39]. Inoltre, l'arricchimento del pathway KEGG ha rivelato 28 geni coinvolti nella biosintesi dei fenilpropanoidi a termine in SC155-14E trattati con flg22. Il percorso di biosintesi dei fenilpropanoidi inizia con la fenilalanina che può essere convertita in composti aromatici come flavonoidi, benzenoidi, cumarina, idrossicinnamati e lignina [58,59]. Molti fenilpropanoidi e flavonoidi sono stati coinvolti nella risposta di resistenza alla malattia [28,60]. La produzione di fitoalessine è un'importante risposta di difesa contro il patogeno dell'antracnosi C. subline-ola [28] nel sorgo. Le 3- desossi antocianidine sono un insolito gruppo di flavonoidi riconosciuti come fitoalessine nel sorgo. Le fitoalessine sono piccole molecole con attività antimicrobica prodotte dopo l'infezione da patogeni [61]. Wang et al. [37] hanno anche scoperto che la biosintesi del fenilpropanoide del termine KEGG era significativamente arricchita in DEG di piante infette da C. subline-ola nel loro studio di trascrittomica del sorgo. Dovremmo notare che i risultati dell'arricchimento del percorso KEGG (Figura 9) hanno anche mostrato una risposta più elevata di BTx623 dopo il trattamento con MAMP in alcuni percorsi che potrebbero svolgere un ruolo nelle interazioni pianta-patogeno (ad esempio, nei percorsi biosintesi della fenilalanina e del triptofano, biosintesi degli antibiotici).

Inoltre, i risultati dell'analisi dell'arricchimento del percorso KEGG dei DEG sottoregolati hanno rivelato che dieci DEG sottoregolati sono stati annotati come "proteine ​​dell'antenna della fotosintesi" e 84 DEG sono stati annotati come partecipanti alla "biosintesi dei metaboliti secondari" sono stati arricchiti in flg22 trattato BTx623. Tuttavia, tali studi sull'espressione genica possono identificare i geni espressi in modo differenziato in risposta al trattamento con MAMP o all'infezione da agenti patogeni, ma non dimostrano necessariamente che questi geni siano fondamentali per la resistenza contro uno specifico agente patogeno. Pertanto, sarebbero necessarie ulteriori ricerche per comprendere le relazioni causali tra la resistenza fungina e l'attivazione di quei percorsi KEGG in entrambi i genotipi, come rivelato dall'analisi RNA-Seq.

Abbiamo anche eseguito l'analisi dell'arricchimento del percorso KEGG per i set principali di DEG in tutte le condizioni (Figura 4C), nonché i DEG co-regolati tra i due genotipi dopo il trattamento con flg22 o chitina (Figura 7C). I risultati hanno rivelato che sei percorsi significativi, tra cui il percorso di interazione pianta-patogeno, sono stati arricchiti solo in insiemi fondamentali di DEG sovraregolati, ma non in insiemi fondamentali di DEG regolati in basso. Allo stesso modo, sette e tre percorsi, incluso il percorso di interazione pianta-patogeno, sono stati significativamente arricchiti in DEG up-regolati con chitina e DEG up-regolati flg22 in BTx623 e SC155-14E, rispettivamente. Al contrario, solo la biogenesi del ribosoma nella via degli eucarioti è stata arricchita in DEG regolati dalla chitina in basso in entrambi i genotipi.

2.5. Convalida dei dati RNA-Seq mediante RT-PCR quantitativa di geni selezionati

Per confermare i dati di profilazione dell'espressione genica ottenuti da RNA-seq, abbiamo eseguito l'analisi qRT-PCR per valutare l'espressione di nove geni candidati selezionati. Quei nove geni sono stati selezionati in base all'espressione osservata da RNA-seq in tre categorie: (a) espressi in modo simile in BTx623 e SC155-14E con flg22 o trattamento con chitina; (b) espresso solo nei MAMP trattati con SC155-14E ma con un'espressione estremamente bassa nel BTx623 trattato e (c) espresso 2–21- volte più alto nei MAMP trattati con SC155-14E rispetto a BTx623 . I risultati dell'analisi qRT-PCR (Tabella 1) hanno rivelato un pieno accordo con i livelli di espressione determinati dall'analisi RNA-seq per ciascuno dei nove geni valutati. Questi risultati ci danno la certezza che le misurazioni effettuate da RNA-seq riflettono la risposta trascrizionale delle linee di sorgo al trattamento con MAMP

2.6. Conclusioni

In questo studio, abbiamo prima trovato le condizioni ottimali per il confronto della risposta MTI dei due genotipi testando la produzione di ROS utilizzando tre serie di foglie e scelto le seconde foglie più giovani di piante di quindici giorni per l'estrazione dell'RNA e la successiva analisi trascrittomica. Un corso temporale della produzione di ROS innescata da flg22- e innescata dalla chitina nella linea di sorgo SC155-14E (Figura 1C) ha rivelato che la produzione di ROS innescata dalla chitina si è verificata prima di quella innescata dal trattamento con flg22. Abbiamo ottenuto i profili di espressione del genotipo SC155-14E del sorgo resistente all'antracnosi resistente all'antracnosi con un'elevata risposta al trattamento con MAMP sulla produzione di ROS e del genotipo suscettibile BTx623 con una bassa risposta sul prodotto ROS al trattamento con MAMP durante le fasi iniziali della risposta immunitaria innata.

I risultati dimostrano una chiara variazione dell'espressione genica nei genotipi di sorgo BTx623 e SC155-14E in risposta al trattamento con MAMP. Sebbene le risposte ai due MAMP abbiano mostrato una notevole sovrapposizione all'interno di ciascuna riga (86,6–70,8 percento), erano distinte. È stata osservata anche una sovrapposizione, sebbene inferiore, (68,3-29%) tra le risposte delle due linee allo stesso MAMP. Un numero considerevole di DEG, 2272 su 10.535 DEG, è stato identificato in tutte e quattro le condizioni e definisce provvisoriamente la risposta MAMP principale. Questo elenco di geni dovrebbe essere utile a quei laboratori che desiderano profilare la risposta dell'espressione genica al trattamento con MAMP. L'analisi RNA-seq ha identificato ampi set di geni espressi in modo differenziato in BTx623 e SC155-14E trattati con flg22 o chitina rispetto ai controlli fittizi non trattati di queste due linee. Inoltre, un confronto tra DEG selezionati utilizzando due diverse pipeline bioinformatiche ha mostrato risultati molto simili. L'analisi dettagliata del profilo di espressione di questi DEG, l'analisi dell'arricchimento GO e l'analisi del percorso KEGG hanno rivelato una chiara variazione nella risposta dell'espressione genica dei due genotipi. Il termine GO e l'arricchimento del percorso KEGG hanno scoperto più DEG correlati all'immunità e alla resistenza ai patogeni (geni PR, risposta dei geni alla chitina, risposta dei geni all'acido salicilico, risposta allo stress, biosintesi dei fenilpropanoidi, ecc.) nelle SC trattate con MAMP{{18} }E campioni relativi a BTx623 con lo stesso trattamento. Queste informazioni forniscono importanti informazioni di base su come il sistema immunitario innato di questa pianta coltivata chiave risponde all'eccitazione dei MAMP. Data la generale mancanza di informazioni sulla risposta immunitaria innata delle piante coltivate, relativa al modello Arabidopsis, gli elenchi di geni e i metodi descritti forniscono una risorsa per un'ulteriore esplorazione della risposta del sorgo ai patogeni e dovrebbero facilitare gli sforzi per migliorare la resistenza alle malattie in questa importante coltura alimentare e da biomassa.

3. Materiali e Metodi

3.1. Materiali vegetali

In questo studio sono state utilizzate due linee di sorgo fornite dal Dr. William Rooney (Texas A&M University, College Station, USA) e dal Dr. Stephen Kresovich (Clemson University, Clemson, USA). BTx623 è una linea di sorgo standard con una sequenza dell'intero genoma disponibile [22], e SC155-14E è una linea sviluppata per la resistenza all'antracnosi [39].

3.2. Saggi ROS

I semi di sorgo di BTx623 e SC155-14E sono stati sterilizzati in superficie (70% di etanolo per 1 minuto e poi 10% di candeggina per 10 minuti, risciacquati con ddH2O autoclavato) e piantati in una miscela di invasatura Sunshine autoclavata e germinati in camere di crescita ( 16 h/8 h chiaro/scuro, 28/26 ◦C, 60–70 percento di umidità). Per gli esperimenti sono state utilizzate piante di quindici giorni.

In questo studio sono stati utilizzati due MAMP, flg22 (catalogo Genscript n. RP19986) e chitina dal guscio di granchio (Sigma-Aldrich, catalogo n. C3641). Flg22 è un peptide derivato dalla flagellina N-terminale di batteri patogeni delle piante ed è ben noto per suscitare una specifica risposta immunitaria innata nelle piante [62]. La chitina è una tipica molecola MAMP derivata dalle pareti delle cellule fungine, che suscita risposte immunitarie nelle piante [3]. I saggi ROS sono stati eseguiti secondo Kimball et al. [38]. Per valutare la variazione della risposta MAMP all'interno dei singoli genotipi, nonché la posizione delle foglie, sono state valutate individualmente tutte e tre le foglie completamente espanse delle piante di ciascun genotipo. Le foglie dal basso verso l'alto delle piante di sorgo di quindici giorni di ciascun genotipo sono state contrassegnate come foglia #1, #2 e #3. Abbiamo utilizzato solo la parte centrale della foglia per il campionamento per misurare la produzione di ROS. Immediatamente dopo i trattamenti, il segnale chemiluminescente di ciascun campione è stato registrato per 30 minuti utilizzando una fotocamera CCD Photek (Photek Ltd., East Sussex UK). Otto pozzetti consistevano in un finto trattamento (senza MAMP) e otto pozzetti consistevano in un trattamento (con MAMP). In ogni caso, per ogni trattamento sono stati confrontati tre replicati biologici con un totale di 8 campioni.

3.3. Trattamento del campione con MAMP

Per gli esperimenti sono state utilizzate piante di quindici giorni. I trattamenti MAMP sono stati eseguiti come descritto in Valdes-Lopez et al. [12] con piccole modifiche. In breve, la seconda foglia (dall'alto, cioè la seconda foglia più giovane) da cinque piante per ciascuna linea di sorgo è stata staccata e quindi infiltrata sottovuoto con ddH2O autoclavato per 2 min. Circa cinquanta dischi fogliari di 1 cm di diametro sono stati tagliati dalle foglie infiltrate d'acqua di ciascun genotipo e raggruppati. Quarantacinque dischi fogliari di ciascun genotipo sono stati trasferiti in tre diverse piastre Petri (15 dischi fogliari in ciascuna piastra Petri) e poi fatti galleggiare per una notte a temperatura ambiente su ddH2O autoclavato con le piastre coperte con un foglio di alluminio. Il giorno successivo, l'acqua è stata rimossa da tutte le piastre Petri e sostituita con 10 mL di ddH2O (finto), 10 mL 1 µM flg22 o 10 mL di soluzione di chitina 20 mg/mL. Dopo un trattamento di 60-minuti, le fette di foglie trattate con simulazione e MAMP sono state raccolte in diverse provette e immediatamente congelate in azoto liquido. I campioni di fette di foglia (per 101quenced "ies ied-11272) immunita'BTx623 e SC155-14E con trattamenti mock, flg22 o chitina, tre repliche biologiche) sono stati conservati a -80 ◦C per l'estrazione dell'RNA. Tutti le procedure sopra descritte sono state eseguite in condizioni di oscurità per eliminare ogni possibile effetto di fotosintesi.

3.4. Estrazione di RNA, sequenziamento e costruzione di librerie

L'estrazione dell'RNA è stata eseguita utilizzando il kit Direct-zol RNA Miniprep Plus di Zymoresearch (catalogo n. R2071) secondo le istruzioni del produttore

Il sequenziamento ad alto rendimento è stato eseguito presso la DNA Core Facility dell'Università del Missouri. Diciotto librerie sono state costruite seguendo il protocollo del produttore con i reagenti forniti nel kit di preparazione del campione a filamento TruSeq mRNA di Illumina. La concentrazione del campione è stata determinata dal fluorimetro Qubit (Invitrogen) utilizzando il kit di analisi dell'RNA Qubit HS e l'integrità dell'RNA è stata controllata utilizzando il sistema di elettroforesi automatizzato Fragment Analyzer. In breve, l'mRNA contenente poli-A è stato purificato dall'RNA totale (1 pg), l'RNA è stato frammentato, il cDNA a doppio filamento è stato generato dall'RNA frammentato e l'indice contenente gli adattatori è stato legato alle estremità. I costrutti di cDNA amplificati sono stati purificati mediante l'aggiunta di perline Axyprep Mag PCR Clean-up. Il costrutto finale di ciascuna libreria purificata è stato valutato utilizzando il sistema di elettroforesi automatizzato Fragment Analyzer, quantificato con il fluorometro Qubit utilizzando il kit di analisi Qubit HS dsDNA e diluito secondo il protocollo di sequenziamento standard di Illumina per il sequenziamento su NextSeq 500. La lunghezza del sequenziamento era singola letto a 75 basi.

3.5. Mappatura ed elaborazione delle letture RNA-Seq

I dati della sequenza rappresentavano sei diverse condizioni: BTx623 con trattamento mock, flg22 o chitina e SC155-14E con trattamento mock, flg22 o chitina. Ciascuna condizione era rappresentata da tre repliche biologiche, risultando in 18 campioni totali. Innanzitutto, le 30 estremità delle letture sono state "tagliate" per gli adattatori Illumina, per i nucleotidi ambigui (N) e (grazie alla tecnologia NextSeq) per il poli-G artificiale (rappresentato come G{100}) utilizzando cutadapt versione 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, consultato il 21 agosto 2019) per le letture le cui 30 estremità si sovrappongono all'adattatore per un minimo di 3 basi con il 90% di identità. Se dopo questo trimming, una lettura conteneva meno di dieci basi veniva scartata (insieme alla sua lettura accoppiata, se applicabile). I punteggi di qualità per i dati di RNA seq dopo il trimming sono stati esaminati utilizzando FASTQC (versione 0.11.9) [63]. Per tutte le posizioni nelle letture, il punteggio di qualità mediano è di circa 34, indicando che l'accuratezza dell'identificazione delle basi è superiore al 99,9%. Le letture per ciascun campione sono state allineate al genoma di riferimento (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) con Tophat 2.1.1. I file di allineamento risultanti sono stati forniti a Cufflinks 2.2.1 per assemblare le trascrizioni per ciascun campione. La versione dell'annotazione utilizzata in questa ricerca era Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. I campioni della stessa condizione sono stati uniti utilizzando Cuffmerge. Lo scopo era quello di fornire una base uniforme per il calcolo dell'espressione genica e del trascritto in ciascuna condizione.

3.6. Analisi bioinformatica dei dati RNA-Seq

I dati di RNA seq sono stati analizzati utilizzando gli strumenti di bioinformatica Bowtie{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 e Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) con parametri predefiniti. Abbiamo utilizzato la stessa pipeline con questi strumenti come descritto in Trapnell et al. [64]. Per confermare ulteriormente i risultati del test, abbiamo utilizzato un'altra pipeline con HiSat2 (versione 2.1.0), HTSeq (versione 0.12.4) e edgeR (versione 3.26.8) per eseguire l'analisi. HiSat2 è il prossimo sviluppo di TopHat2. Innanzitutto, abbiamo utilizzato HiSat2 per eseguire l'allineamento utilizzando il genoma di riferimento del sorgo. Quindi abbiamo utilizzato HTSeq per contare quante letture sono state mappate su ciascun gene. Per questo, avevamo bisogno dei file bam generati dal passaggio precedente e dell'annotazione del genoma (file gif). Si noti che il genoma di riferimento e i file di annotazione sono gli stessi utilizzati nella pipeline originale. Infine, abbiamo utilizzato il pacchetto R edgeR per determinare i geni differenzialmente espressi in ciascuna condizione

3.7. Identificazione di geni espressi differenzialmente
L'assemblaggio unito è stato inviato a Cuffdiff, che calcola i livelli di espressione e testa la significatività statistica dei cambiamenti osservati tra due condizioni. Abbiamo confrontato le condizioni tra mock vs. flg22 e mock vs. chitin per BTx623 e SC155-14E, rispettivamente. I geni espressi in modo differenziale sono stati estratti utilizzando le soglie del valore p 0.001. I grafici del vulcano sono stati realizzati utilizzando il pacchetto R (ggplot2 V3.3.0) per mostrare il significato del cambiamento di espressione genica nelle condizioni BTx623 trattate rispettivamente con flg22 o chitina e SC155- 14E trattate con flg22 o chitina. I punti del gene con −log10 (valore p) uguale o maggiore di tre sono stati considerati DEG. In ogni grafico, i punti del gene con log2 (fold_change) maggiore di zero erano geni up-regolati, altrimenti geni down-regolati.

3.8. Trama PCA

Per esaminare la relazione tra i valori di espressione genica di tre repliche biologiche di ciascuna linea di sorgo e ciascun trattamento MAMP, sono stati generati grafici di analisi dei componenti principali (PCA) utilizzando i pacchetti R (ggfortify V{{0}}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). Ogni punto rappresenta una condizione dopo la mappatura dallo spazio delle caratteristiche originali (espressione genica) ai primi due componenti principali. I punti appartenenti alla stessa condizione tendono a raggrupparsi insieme

3.9. Mappa termica dei DEG

1 Divisione di Scienza e Tecnologia delle Piante e Biochimica, CS Bond Life Sciences Center, Università del Missouri, Columbia, MO 65211, USA; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 Dipartimento di Ingegneria Elettrica e Informatica, CS Bond Life Sciences Center, Università del Missouri, Columbia, MO 65211, USA; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Unità di ricerca sulla scienza delle piante, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, USA

* Correspondence: staceyg@missouri.edu