Yishen Qingli Heluo Granule nel trattamento della malattia renale cronica: analisi farmacologica di rete e validazione sperimentale Ⅱ
Dec 07, 2023
Risultati
Informazioni sui composti attivi e obiettivi correlati di YQHG
Un totale di 63 composti attivi di YQHG sono stati selezionati dal database TCMSP e dall'estrazione della letteratura su larga scala. Tutti i composti attivi soddisfacevano il metodo di filtraggio ADME, OB maggiore o uguale a 30% e DL maggiore o uguale a 0,18. Il numero di composti per ciascuna erba in YQHG era 17 (NX), 13 (TFL), 16 (HQ), 10 (HZ), 10 (DH), 8 (HJ), 5 (SW), 2 (DG), 2 (JXC), 1 (LYX) (Tabella S1). Tra i 63 composti attivi, 9 erano presenti in più di un'erba. Ad esempio, il composto quercetina potrebbe essere trovato in 6 erbe (HQ, NX, HZ, TFL, SW, JXC) di YQHG. Abbiamo identificato 250 target per 63 composti attivi (Tabella S2). Il numero di potenziali bersagli interessati dai composti attivi di HQ, NX, HZ, TFL, SW, JXC, HJ, DH, DG e LYX erano 208, 201, 193, 174, 169, 150, 55, 43, 30 e 11 , rispettivamente. Molti composti attivi esercitano i loro effetti farmacologici legandosi a più di un bersaglio contemporaneamente. Ad esempio, wogonin, come composto attivo in NX, può interagire con 43 target, tra cui TP53, CASP3, PTGS2, IL-6 e così via.
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Obiettivi candidati di YQHG contro la CKD
Attraverso lo screening del database, sono stati ottenuti 1161 target correlati alla CKD (526 nel database OMIM, 379 nel database DisGeNET, 331 nel database GeneCards, 113 nel database MalaCards e 73 nel database TTD). Gli obiettivi di intersezione sono stati mostrati da un diagramma di Venn (Figura 2A).
Figura 2 Diagrammi di Venn. (A) Gli obiettivi della CKD. I target relativi alla CKD sono stati ottenuti da cinque database (OMIM, DisGeNET, GeneCards, MalaCards, TTD). (B) Obiettivi candidati di YQHG nel trattamento della CKD.
I potenziali obiettivi di YQHG sono stati sovrapposti con obiettivi relativi alla CKD dalla piattaforma Venn (Figura 2B). Un totale di 79 bersagli intersecanti sono stati selezionati come bersagli candidati per YQHG contro CKD (Tabella 2). In questo lavoro, abbiamo studiato la distribuzione dei target rilevanti per la CKD tra le 10 erbe (72 da HQ, 72 da HZ, 69 da NX, 64 da SW, 64 da TFL, 59 da JXC, 21 da HJ, 15 da DH, 9 da DG, 2 da LYX) tramite un'analisi di Venn. Questi 79 target sono stati quindi utilizzati per costruire la rete H-CT da Cytoscape.
Visualizzazione della rete
(1) C-T network. To reveal the synergistic effects of multi-compound and multi-target in the 10 herbs of YQHG (Figure 3A) and evaluate its mechanism of action, a C-T network analysis was carried out (Figure 3B). The active compounds corresponding to the abbreviations in Figure 3 were shown in Table S1. The C-T network consisted of 63 active compounds, 250 targets, and 914 C-T interactions (313 nodes and 914 edges). The average degree centrality, betweenness centrality, and closeness centrality values were 14.67, 0.02, and 0.33, respectively. The above topological parameters of 12 compounds were higher than the average, which were shown in Table 3. These compounds were considered to be the main active compounds of YQHG in the treatment of CKD. The average number of targets for each herb was 123, indicating the multi-target properties of these herbs. A total of 31 key targets satisfied the screening rules (degree centrality>3.656, betweenness centrality>0.003, closeness centrality>0.333), of which PTGS2 has the highest filtering parameters (degree centrality=41, betweenness centrality=0.085, closeness centrality=0.516). (2) H-CT network. To explore the synergistic effects of YQHG at the individual herb level, we constructed a H-CT network (Figure 3C). We found that 6 herbs covered more than 75% of the 79 candidate targets, of which HQ and HZ both covered 91%. Interestingly, the 10 herbs in YQHG shared a common target, which is PTGS2. The existence of this target is a manifestation of the synergistic effect of TCM, which may be involved in the pathological process of CKD. (3) PPI network. The proteins with a combined score>0.90 sono stati scelti per costruire la rete PPI (Figura 3D). Il parametro "Grado" è stato utilizzato per valutare l'importanza topologica dei nodi della rete. Le prime 6 proteine ottenute dall'analizzatore di rete nel software Cytoscape sono state TP53, AKT1, RELA, IL6, MAPK1 e ESR1. Successivamente, i primi 6 composti attivi (quercetina, kaempferolo, luteolina, 7-O-metilisomucronulatolo, wogonin, stigmasterolo) e sei target proteici selezionati attraverso le reti CT e PPI sono stati utilizzati per ulteriori analisi.
Analisi dell'arricchimento GO e KEGG
I termini GO sono stati classificati in base al processo biologico, alla funzione molecolare e alla componente cellulare e i primi 10 sono stati mostrati nella Figura 4A. Le proteine bersaglio candidate della categoria della funzione molecolare erano per lo più associate all'attività di attivatore del recettore e all'attività del recettore-ligando. Le proteine bersaglio nella categoria dei componenti cellulari sono state arricchite nel microdominio e nella zattera di membrana. Per quanto riguarda il processo biologico GO, ha svolto un ruolo importante nei tre termini GO sopra menzionati. Pertanto, chiarire il processo biologico rilevante dell’YQHG contro la CKD ha evidenziato in una certa misura la direzione del meccanismo. Secondo 79 possibili bersagli di YQHG nel trattamento della malattia renale cronica, sono stati identificati i 10 principali processi biologici. Si sono concentrati su due aree: (1) Regolazione del ciclo cellulare e dell'apoptosi (proliferazione delle cellule epiteliali, regolazione della via di segnalazione apoptotica, regolazione negativa della via di segnalazione apoptotica). (2) Regolazione del processo metabolico delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) (risposta allo stress ossidativo, processo metabolico delle specie reattive dell'ossigeno, risposta ai livelli di ossigeno, risposta cellulare allo stress ossidativo, risposta alle specie reattive dell'ossigeno, regolazione del processo metabolico delle specie reattive dell'ossigeno, regolazione positiva del processo metabolico delle specie reattive dell'ossigeno). Per chiarire ulteriormente i potenziali meccanismi di YQHG contro la CKD, abbiamo esaminato i primi 40 percorsi KEGG mediante clusterProfiler (Figura 4B). I risultati hanno mostrato che 8 importanti vie di segnalazione (p53, recettore Toll-like, VEGF, recettore delle cellule T,
Docking molecolare di composti attivi e proteine fondamentali
Per verificare ulteriormente l'accuratezza della farmacologia di rete, l'affinità di legame tra i composti attivi chiave e le proteine hub è stata analizzata mediante il metodo di docking molecolare basato sul software Autodock Vina. L'affinità di legame dei sei composti attivi (quercetina, kaempferolo, luteolina, 7-o-metilisomucronulatolo, wogonin, stigmasterolo) con le proteine hub (TP53, AKT1, RELA, IL6, MAPK1, ESR1) era inferiore a -5 kcal/mol, indicando che possedevano una buona attività legante. I dettagli dell'affinità di legame sono stati mostrati nella Tabella 4. Il legame a idrogeno svolge un ruolo fondamentale nella stabilizzazione delle interazioni di legame composto-proteina. Pertanto, si garantisce che la distanza di legame favorevole tra gli atomi donatori di H e quelli accettori di H sia inferiore a 3,5 Å [24]. Quercetina, Kaempferol e Luteolina sono risultati i migliori nella modalità di legame con sei proteine nel presente studio. Inoltre, è stato stabilito un approccio UHPLC-MS per rivelare la stabilità di YQHG (Figura S2A e B) e quantificare i composti attivi chiave (quercetina, kaempferolo e luteolina) nell'estratto (tabella S3 e figure S2C e D). I risultati dell'aggancio del composto e della proteina con la migliore conformazione sono stati mostrati nella Figura 5.
YQHG ha migliorato la funzione renale e la fibrosi in 5/6 ratti nefrectomizzati
Per esplorare il potenziale valore terapeutico è stata condotta una valutazione completa dell’aspetto renale (colore, capsula, bordo), dei parametri correlati (Scr, BUN, proteine urinarie, area di fibrosi glomerulare, area di fibrosi tubulointerstiziale) e della patologia del tessuto renale (H&E, Masson). di YQHG sulla CKD. A tal fine, sono stati stabiliti il modello di nefrectomia 5/6 e il regime di dosaggio YQHG (Figura 6A). Come previsto, il gruppo modello ha mostrato perdita di peso, reni pallidi, bordi irregolari e capsule difficili da sbucciare. Sorprendentemente, il trattamento con YQHG in modo dose-dipendente ha impedito la progressione della malattia, come dimostrato dall'aumento del peso corporeo dei ratti, dal recupero dei reni bruno-rossastri, dall'integrità dei bordi e dalla levigatezza delle capsule (Figura 6B e C). Scr, BUN e proteine urinarie sono i marcatori chiave che indicano la disfunzione renale. I nostri risultati hanno mostrato che rispetto al gruppo modello, YQHG ha ridotto significativamente i livelli dei tre parametri in modo dose-dipendente (Figura 6D-F). L'analisi istopatologica ha mostrato chiaramente infiltrazione infiammatoria, espansione mesangiale, atrofia e dilatazione tubulare, sclerosi glomerulare e fibrosi interstiziale in 5/6 ratti nefrectomici, tutti drammaticamente migliorati dal trattamento YQHG (Figura 6G). Inoltre, durante il trattamento con YQHG sono stati esaminati gli indicatori istopatologici, tra cui l'area della fibrosi glomerulare e l'area della fibrosi tubulointerstiziale. Qui, abbiamo scoperto che il trattamento YQHG ha ridotto significativamente l'area della fibrosi glomerulare (Figura 6H). Inoltre, il trattamento HD YQHG ha ridotto significativamente l'area della fibrosi tubulointerstiziale (Figura 6I). Nel loro insieme, questi dati hanno indicato che YQHG ha avuto un profondo effetto protettivo su 5/6 ratti nefrectomizzati, caratterizzato dall'alleviamento del danno tissutale, dal miglioramento della funzione renale e dalla riduzione della fibrosi renale.
YQHG ha rimodellato il microbiota intestinale riducendo il rapporto Firmicutes/Bacteroidota in 5/6 ratti nefrectomizzati
Le erbe MTC interagiscono strettamente con il microbiota intestinale e ne influenzano la composizione.30 Al contrario, il microbiota intestinale svolge anche un ruolo importante nella conversione di carboidrati, proteine, lipidi e piccole sostanze chimiche non nutritive provenienti dalle erbe MTC in metaboliti chimici che possono avere effetti benefici o effetti avversi sulla salute umana.31 Dato che l'omeostasi del microbiota intestinale svolge un ruolo importante nell'efficacia delle erbe MTC,32-34 abbiamo quindi studiato gli effetti di YQHG sul microbiota intestinale in 5/6 ratti nefrectomizzati. Abbiamo analizzato il microbiota intestinale a due diversi livelli tassonomici (phylum e genere). PCoA ha rivelato che la composizione microbica intestinale dei gruppi YQHG era vicina a quella del gruppo fittizio e distinta da quella del gruppo modello (Figure 7A e F). L'analisi della comunità a livello di phylum ha mostrato che, rispetto al gruppo fittizio e ai gruppi YQHG (Figura 7B), la composizione microbica intestinale del gruppo modello è cambiata in alcuni batteri, come Firmicutes e Bacteroidota. Nello specifico, il trattamento LD YQHG ha ridotto significativamente l'abbondanza di Firmicutes (Figura 7C) e ha aumentato l'abbondanza di Bacteroidota (Figura 7D). È importante sottolineare che il rapporto tra questi due batteri è stato significativamente ridotto dal trattamento YQHG in modo dose-dipendente (Figura 7E). Inoltre, il microbiota intestinale a livello di genere è stato rimodellato nei gruppi YQHG, come mostrato dal grafico a barre della comunità e dal grafico di Circos (Figura 7G e H). Nel loro insieme, questi risultati hanno dimostrato che il trattamento YQHG ha ripristinato efficacemente la composizione del microbiota intestinale e ha ridotto il rapporto Firmicutes/Batteroidota (F/B), promuovendo così la normalizzazione dell’ecosistema microbico intestinale al fine di esercitare l’effetto curativo delle erbe MTC.
YQHG ha regolato l'espressione di PTGS2, P53 e IL-6 in 5/6 ratti nefrectomizzati
La rete H-CT, l'analisi dell'arricchimento del percorso KEGG e il docking molecolare hanno previsto che tre target proteici chiave (PTGS2, p53, IL6) fossero coinvolti nell'YQHG contro la CKD. Pertanto, le espressioni di PTGS2 e p53 sono state esaminate durante il trattamento con YQHG. Qui, abbiamo scoperto che il trattamento HD YQHG ha ridotto significativamente l'espressione di PTGS2 nel tessuto renale (Figura 8A e B). Inoltre, HD YQHG potrebbe regolare l'espressione di p53 in una certa misura (Figura 8A e C). Successivamente, abbiamo valutato l'effetto inibitorio di YQHG sull'espressione di IL6. Dopo il trattamento con YQHG, l'espressione di IL6 era significativamente ridotta nel tessuto renale (Figura 8D).
Figura 5 La modalità di legame della proteina con il composto. (A) La modalità di legame della proteina ESR1 con la luteolina. (B) La modalità di legame della proteina MAPK1 con la quercetina. (C) La modalità di legame della proteina TP53 con la luteolina. (D) La modalità di legame della proteina AKT1 con Kaempferol. (E) La modalità di legame della proteina RELA con la quercetina. (F) La modalità di legame della proteina IL6 con la quercetina. Ogni immagine mostra tre aree: (I) La struttura 3D del complesso. (II) La superficie del sito attivo. (III) La modalità di legame di dettaglio del complesso. La struttura portante delle proteine è rappresentata in un tubo e colorata in verde. Il composto è reso dal giallo. Il trattino giallo rappresenta la distanza del legame idrogeno o l'impilamento π
Figura 6 YQHG migliora la funzionalità renale e la fibrosi in 5/6 ratti nefrectomizzati. (A) Costruzione del modello di nefrectomia 5/6 e del programma di dosaggio YQHG. (B) Il rene dei ratti è stato fotografato (n=6). (C) È stato misurato il peso corporeo dei ratti (n=6). (D – F) Effetti del trattamento YQHG sui livelli di Scr, BUN e proteine urinarie in 5/6 ratti nefrectomizzati (n=6). (G) Immagini rappresentative della colorazione H&E (4{{20}}×ingrandimento, barra della scala 20μm) e colorazione di Masson (40×ingrandimento, barra della scala 20μm) dei tessuti renali (n =6). (H–I) Analisi quantitativa dell'area della fibrosi glomerulare e dell'area della fibrosi tubulointerstitale basata sulla colorazione di Masson (n=6). Tutti i dati sono espressi come media±SEM. Per i dati distribuiti normalmente (peso corporeo, Scr, proteine urinarie, area di fibrosi glomerulare, area di fibrosi tubulointerstitale), è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale seguita dal test di Tukey. Per i dati non distribuiti normalmente (BUN), è stato utilizzato il test di Kruskal-Wallis seguito dal test non parametrico della somma dei ranghi di Wilcoxon. **P < 0,01 rispetto al gruppo fittizio; # P < 0,05, ##P < 0,01 rispetto al gruppo del modello.
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