Una delezione di cinque aminoacidi nell'NKCC2 dei topi C57BL/6 influisce sull'analisi della fosforilazione dell'NKCC2 ma non influisce sulla funzione renale

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INTRODUZIONE

Il grosso arto ascendente (TAL) del mammiferoreneè fondamentale per il controllo del volume del fluido extracellulare, della concentrazione urinaria, dell'omeostasi del calcio (Ca 2 plus ) e del magnesio (Mg 2 plus ), nonché dell'equilibrio del pH. 1 La principale via di trasporto di Na più nel TAL è il cotrasportatore Na più - K più - 2 Cl - (NKCC2), che è specificamente inibito dai diuretici dell'ansa. 1 Il cotrasporto di ioni Na plus , K plus e 2Cl − attraverso NKCC2 è elettroneutro ma dipende dalla secrezione elettrogenica di K plus attraverso l'apice renalemidollo esterno K più canale ROMK. 2 L'interazione di NKCC2 con ROMK crea un gradiente elettrochimico positivo al lume, che migliora il riassorbimento di Na plus e guida il trasporto paracellulare di Ca 2 plus e Mg 2 plus . 3 Il significato di NKCC2 per TAL efunzione renaleè esemplificato dalla sindrome di Bartter di tipo I, una malattia genetica causata da mutazioni con perdita di funzione in NKCC2, che si manifesta con graverenaleperdita di sali e liquidi, alcalosi metabolica ipokaliemica e ipercalciuria. 3

NKCC2 è membro della famiglia di soluti carrier 12 (Slc12) di proteine ​​di trasporto di membrana che include anche l'NKCC1 espresso ubiquitariamente e il Na più - Cl - cotrasportatore (NCC) specifico del tubulo contorto distale (DCT). 2 L'attività di NKCC2 correla positivamente con la fosforilazione del cotrasportatore a diversi residui di serina e treonina sulla coda N-terminale citoplasmatica. 4 Le sequenze di amminoacidi che circondano questi siti di fosforilazione sono altamente conservate e mostrano un alto grado di somiglianza tra NKCC2, NKCC1 e NCC. 2 La fosforilazione di NKCC2 è stimolata da diverse vie ormonali e non ormonali. Ormoni come l'arginina vasopressina (AVP) e l'angiotensina II (ANGII) stimolano l'NKCC2 attraverso una maggiore produzione di cAMP e l'attivazione della protein chinasi A (PKA). Si ritiene che 5 PKA fosforili direttamente NKCC2 in Ser126, il che migliora l'esocitosi delle vescicole contenenti NKCC2 e quindi l'abbondanza del trasportatore nella membrana plasmatica apicale. 6 Allo stesso modo, i cambiamenti nelle concentrazioni di cloruro intracellulare regolano la fosforilazione di NKCC2. Una ridotta concentrazione di Cl tracellulare stimola le chinasi senza lisina(K) WNK1 e WNK4 a fosforilare e ad attivare le chinasi a valle Ste20- chinasi ricca di prolina alanina correlata (SPAK) o la chinasi 1 reattiva allo stress ossidativo (OXSR1 ). 7- 9 Dopo essersi legate a un motivo "RFxV" in NKCC2, queste chinasi fosforilano NKCC2 in due residui di treonina (T96 e T101). 2 La defosforilazione di questi residui è mediata dalla fosfatasi calcineurina, sottolineando che NKCC2 è un bersaglio per diverse vie di segnalazione. 10

Per studiare la funzione di NKCC2, diversi gruppi, incluso il nostro, hanno sviluppato anticorpi specifici per fosfoformi contro Thr96 e/o Thr101. 11- 17 Gli anticorpi sono stati utilizzati per valutare la fosforilazione di NKCC2 nei sistemi di espressione eterologhi 7,11,17,18,19,20 e nei modelli animali inclusi ratti 10,21,22,23,24,25 e topi. 14,15,16,17,19,26,27 Tuttavia, quando abbiamo utilizzato il nostro anticorpo pT96/101 NKCC2, abbiamo ottenuto risultati incoerenti nei nostri diversi modelli murini. Mentre abbiamo rilevato forti segnali pNKCC2 nei reni dei topi in un background genetico 129Sv, non abbiamo ottenuto segnali pNKCC2 affidabili nei reni dei topi C57BL/6 ma abbiamo osservato una reattività crociata degli anticorpi pNKCC2 con pNCC. Altri laboratori, inclusi quelli di JA McCormick e AA McDonough (comunicazione personale) hanno fatto osservazioni simili. 18,28,29 Inoltre, sono state descritte notevoli differenze di ceppo nei topi perrenalefunzione 30 inclusa l'escrezione di Ca 2 urinaria significativamente più bassa in C57BL/6 rispetto ai topi 129Sv. 31 Pertanto, abbiamo ipotizzato che i topi C57BL/6 esprimano una variante genetica di NKCC2 che influisce sulla fosforilazione di NKCC2 e possibilmentefunzione renaleche spiegano le differenze di deformazione osservate. Il seguente studio è stato progettato per verificare sistematicamente questa ipotesi.

Parole chiave:omeostasi ionica, rene, NKCC2, fosforilazione, differenze di deformazione

RISULTATI

2.1|I topi C57BL/6 hanno una delezione di cinque amminoacidi in NKCC2 che interferisce con il rilevamento di NKCC2 fosforilatoIn primo luogo, abbiamo allineato per diverse specie le sequenze di amminoacidi N-terminali pubblicate (ID di trascrizione nella Tabella S1) di NKCC2 e NCC (Figura 1A, B, rispettivamente) che corrispondono agli epitopi riconosciuti dagli anticorpi anti-pNCC e anti-pNKCC (Figura 1C). L'allineamento ha confermato l'alto grado di conservazione dei siti di fosforilazione di NKCC2 e NCC 7 che probabilmente spiega la reattività crociata degli anticorpi pNKCC2 e pNCC osservati da noi e da altri. 18,28,29 Interessante e coerente con la nostra ipotesi, l'allineamento ha anche rivelato una delezione di cinque amminoacidi finora non apprezzata nella sequenza di NKCC2 da topi C57BL/6 (ΔF97- T101) (Figura 1A) . Il sequenziamento del DNA di due diverse colonie di topi C57BL/6 conservate presso il Jackson Laboratory negli Stati Uniti o Janvier Labs in Francia ha confermato una delezione di nucleotidi nell'esone 2 di C57BL/6 NKCC2 che corrisponde alla delezione di amminoacidi sopra menzionata (Figura S1 ,Tabella S2).

Per caratterizzare l'impatto della delezione di cinque amminoacidi sull'immunorilevamento di NKCC2 totale e fosforilato, abbiamo studiato sistematicamente i reni di topi C57BL/6 e 129Sv mediante immunoistochimica e immunoblotting. L'immunofluorescenza con un anticorpo contro NKCC2 totale ha mostrato un forte segnale fluorescente nella membrana plasmatica apicale dei TAL di topi 129Sv e C57BL/6. Tuttavia, il nostro anticorpo pT96/T101 NKCC2 precedentemente sviluppato ha mostrato una forte etichettatura apicale dei TAL solo nei topi 129Sv, mentre i TAL dei topi C57BL/6 avevano un'immunocolorazione molto debole (Figura 1D). Coerentemente con ciò, l'analisi Western blot ha rivelato una banda forte per NKCC2 totale in entrambi i ceppi di topi, mentre l'anticorpo pT96/T101 NKCC2 ha rilevato una banda forte alla dimensione prevista (170 kDa) solo nei topi 129Sv (Figura 1E). Invece, i reni dei topi C57BL/6 hanno rivelato una banda a 130 kDa che corrisponde alla dimensione prevista di NCC (Figura 1E). Risultati simili sono stati ottenuti con altri anticorpi precedentemente utilizzati per studiare la fosforilazione di NKCC2 (Figura S2). L'anticorpo 11 pT212/T217 NKCC1 R5 ha mostrato, oltre al segnale pNCC, un debole segnale alla dimensione prevista per pNKCC2 (Figura S2). La banda immunoreattiva per pNKCC2 è diventata più intensa quando era frescarenesono stati utilizzati lisati. L'uso di un tampone di lisi con detergenti (tampone RIPA) non ha migliorato ma ha ridotto l'intensità del segnale (Figura S3).

FIGURA 1 L'anticorpo pT96/T101 NKCC2 non rileva un segnale pNKCC2 visibile nei topi C57BL/6. A, NKCC2 allineamento della sequenza di amminoacidi di specie diverse e i due ceppi di topo 129Sv e C57BL/6. Gli ID di sequenza NKCC2 per le diverse specie sono elencati nella Tabella S1. La regione altamente conservata corrispondente a Thr96 murino e Thr101 murino è contrassegnata in grigio. B, Allineamento della sequenza di amminoacidi di NCC in diverse specie. Gli ID sequenza NCC per le diverse specie sono elencati nella Tabella S1. C, Elenco di epitopi di anticorpi comunemente usati e pubblicati che riconoscono pT53 o pT58NCC, nonché pNKCC2 nel locus conservato intorno a Thr96 a Thr101. D, Immunocolorazione del totale e pT96/T101 NKCC2 in crio-sezioni consecutive di topi con sfondo 129Sv e C57BL/6. Barra della scala=50 µm. E, Immunoblot del totale e pT96/T101 NKCC2 di topi con sfondo 129Sv e C57BL/6. I valori sono medie ± SEM, n=5 topi per gruppo, le frecce verdi indicano le bande specifiche mentre le punte delle frecce rosse indicano le bande non specifiche. Sono inclusi i marcatori di peso molecolare. Le bande totali e pT96/T101 NKCC2 sono previste a 170 kDa. F, Immunoblots per totale e pT96/T101 NKCC2, totale e pT53 e pT58 NCC in topi knockout (KO) NCC WT e NCC di sfondi diversi. Le frecce verdi indicano le bande specifiche mentre le punte delle frecce rosse indicano le bande non specifiche. Sono inclusi i marcatori di peso molecolare. Le bande NCC totali e pT58 e pT53 sono attese a 130 kDa, le bande totali e pT96/T101 NKCC2 sono attese a 170 kDa

Per verificare se il nostro anticorpo pT96/T101 NKCC2 reagisce effettivamente con l'NCC fosforilato nei topi C57BL/6, abbiamo sondatorenelisati da topi wild-type 129Sv e C57BL/6 e topi knockout C57BL/6 NCC con anticorpi contro NKCC2 totale, pT96/T101 NKCC2, NCC totale e NCC fosforilato (pT53 e pT58 NCC) (Figura 1F). L'anticorpo pT96/T101 NKCC2 e gli anticorpi contro NCC totale e pNCC non hanno rilevato bande a 130- 170 kDa nei topi knockout C57BL/6 NCC (Figura 1F). È interessante notare che l'immunoblot e altri esperimenti di immunoistochimica (Figura S4) indicano che non solo gli anticorpi pNKCC2 reagiscono in modo incrociato con l'NCC nei topi C57BL/6, ma i nostri anticorpi pNCC (pT53 NCC e pT58 NCC) reagiscono in modo incrociato con NKCC2 in 129Sv topi alle concentrazioni utilizzate.

L'escrezione urinaria di calcio e magnesio differisce tra i topi 129Sv e C57BL/6

Per determinare se la delezione (F97- T101) in NKCC2 può associarsi a differenze fisiologiche tra i topi 129Sv e C57BL/6, abbiamo confrontato l'assunzione di acqua, i livelli di ioni plasmatici e il fluido urinario e l'escrezione di ioni tra i due ceppi di topo. Come riassunto nella tabella 1, la maggior parte dei parametri valutati non differiva tra i ceppi. Tuttavia, i topi C57BL/6 hanno mostrato un'escrezione urinaria inferiore di Ca 2 plus e una maggiore escrezione urinaria di Mg 2 plus rispetto ai topi 129Sv. I livelli plasmatici di Ca 2 plus e Mg 2 plus erano simili per entrambi i gruppi, suggerendo che i topi erano in uno stato stazionario in cui un equilibrio omeostatico di riassorbimento intestinale, mobilizzazione dei tessuti (ad es. dall'osso) erenaleè stata raggiunta l'escrezione di ioni Ca 2 plus e Mg 2 plus. Per verificare se i diversi tassi di escrezione urinaria di Ca 2 plus e Mg 2 plus derivano da differenze nell'assorbimento intestinale di questi ioni, abbiamo confrontato l'assunzione giornaliera di cibo, la produzione fecale e l'escrezione fecale di Ca 2 plus e Mg 2 plus per i due ceppi di topo. Come mostrato nella Figura S5, l'assunzione di cibo e l'uscita fecale di Ca 2 plus erano simili, ma l'escrezione giornaliera fecale di Mg 2 plus era inferiore nei topi C57BL/6 rispetto ai topi 129Sv, suggerendo che i topi C57BL/6 hanno un maggiore riassorbimento intestinale di Mg 2 più di topi 129Sv. Coerentemente con questa ipotesi, i topi C57BL/6 avevano un'espressione del colon più forte del canale del magnesio TRPM6 (Figura S6), nonché una tendenza a livelli plasmatici di Mg 2 più elevati rispetto ai topi 129Sv, sebbene le differenze non raggiungessero la significatività statistica. Per valutare il possibile contributo dell'osso, abbiamo analizzato mediante microTC la densità minerale ossea in entrambi i ceppi. Simile ai rapporti precedenti, 32 topi C57BL/6 avevano una densità minerale ossea piuttosto bassa (Figura S7), il che potrebbe spiegare perché questi topi tendono a conservare ioni Ca 2 plus attraverso una riduzionerenaleCa 2 più escrezione. Coerentemente con un aumento del tasso di riassorbimento tubulare di Ca 2 più, i reni dei topi C57BL/6

espresso più canale TRPV5 Ca 2 plus a livelli proteici rispetto ai reni dei topi 129Sv (Figura 2). I topi C57BL/6 avevano anche un'espressione di mRNA e proteine ​​NCC significativamente maggiore rispetto ai topi 129Sv (Figura 2A). Allo stesso modo, l'abbondanza proteica di NKCC2 totale, NCC totale e fosforilato e di ENaC totale era maggiore in C57BL/6 rispetto ai topi 129Sv (Figura 2B,C). Le abbondanze delle forme proteoliticamente scisse e quindi attive di - e - ENaC non erano diverse suggerendo che ilrenaleL'attività di ENaC era simile per entrambi i ceppi (Figura 2B,C).

Nessuna evidenza di un'alterata funzione dell'arto ascendente spesso nei topi C57BL/6 rispetto ai topi 129Sv

Le maggiori abbondanze di NKCC2 totale, NCC totale e NCC fosforilato nei reni di topi C57BL/6 possono essere una risposta compensatoria per una ridotta fosforilazione di NKCC2. Per verificare se l'attività di NKCC2 e NCC differisce tra i ceppi di topo, abbiamo eseguito rispettivamente un test bumetanide e tiazidico. Una singola iniezione di bumetanide o idroclorotiazide ha provocato una forte natriuresi, più pronunciata per la bumetanide che per l'idroclorotiazide. Tuttavia, le risposte diuretiche erano completamente simili in entrambi i ceppi, suggerendo che le attività funzionali di NKCC2 e NCC non erano diverse tra i topi C57BL/6 e 129Sv (Figura 3A-D). Apparentemente, le abbondanze proteiche e i livelli di fosforilazione non corrispondono necessariamente alle attività funzionali direnaleproteine ​​di trasporto ionico, come recentemente sottolineato anche da Hunter e collaboratori. 33 Per valutare ulteriormente la funzione del TAL, abbiamo eseguito un test di restrizione idrica in cui i topi hanno avuto accesso per 24 ore al cibo umido, ma non all'acqua del rubinetto. In queste condizioni, entrambi i ceppi di topo hanno aumentato l'osmolarità delle urine a valori simili (Tabella 1). Inoltre, topi C57BL/6 e topi 129Sv hanno mostrato la stessa escrezione urinaria di uromodulina (proteina Tamm-Horsfall) (Tabella 1), che viene prodotta ed escreta nelle urine a seconda dell'attività funzionale delle cellule TAL. 3

L'incrocio di topi 129Sv e C57BL/6 suggerisce che la delezione di cinque amminoacidi in NKCC2 non segrega un fenotipo specifico

I dati presentati suggeriscono che le differenze di ceppo nelle escrezioni di ioni urinari erenalele abbondanze proteiche non sono correlate alla delezione di cinque amminoacidi in C57BL/6 NKCC2, ma sono correlate ad altre differenze genetiche tra i due ceppi di topo. Per testare ulteriormente questo, abbiamo incrociato topi 129Sv e C57BL/6 con la generazione F2 in cui le differenze di ceppo genetico (comprese quelle in NKCC2) dovrebbero essere casuali

distribuito ai topi. Abbiamo quindi confrontato i topi F2 che erano omozigoti per NKCC2 a lunghezza intera (f/f), omozigoti per la delezione NKCC2 (Δ/Δ) o eterozigoti per la delezione NKCC2 (f/Δ). Con l'eccezione dei diversi schemi di legame previsti degli anticorpi specifici per fosfoformio contro NKCC2 e NCC (e una differenza poco chiara dell'espressione di ROMK a livello di mRNA, ma non a livello di proteine), nessuna delle differenze precedentemente identificate tra i due ceppi era evidente in i topi f/f, Δ/Δ o f/Δ della generazione F2 (Figura 4 e Tabella 2). In particolare, non ci sono state differenze nell'escrezione urinaria di Ca 2 plus o Mg 2 plus, così come nessuna differenza nei livelli plasmatici di Ca 2 plus o Mg 2 plus, suggerendo che le differenze di ceppo tra i topi 129Sv e C57BL/6 sono indipendenti da la delezione dei cinque amminoacidi in NKCC2.

Un nuovo anticorpo pT96 NKCC2 rileva pNKCC2 in entrambi i ceppi

Poiché la delezione di cinque amminoacidi in NKCC2 ostacola un rilevamento affidabile della fosforilazione di NKCC2 nei topi C57BL/6 quando si utilizzano gli anticorpi disponibili, abbiamo generato un nuovo anticorpo diretto contro il fosfosito T96 nei topi C57BL/6. I conigli sono stati immunizzati con un fosfopeptide che corrispondeva alla sequenza aminoacidica di C57BL/6 NKCC2 che circondava T96 (YYLQ(p)TMDA). Gli antisieri sono stati purificati per affinità e caratterizzati da immunoblotting e immunoistochimica (Figura 5). L'anticorpo ha rilevato una singola banda alla dimensione prevista di 170 kDa nei reni di 129Sv, C57BL/6 wild-type e C57BL/6 NCC knock-out

topi (Figura 5A). La banda era chiaramente diversa da quella rilevata per NCC a 130 kDa. Defosforilazione di 129Svrenecampioni con fosfatasi alcalina intestinale di vitello (CIAP) hanno completamente sradicato il segnale ottenuto con il nuovo anticorpo pT96 NKCC2, mentre il segnale con l'anticorpo NKCC2 non specifico per fosfoformi era visibile nei campioni di controllo e defosforilati (Figura 5B). È interessante notare che anche la fosforilazione di NKCC2 è stata in gran parte eliminata quandorenei lisati sono stati incubati a 37 gradi per 1 ora senza CIAP (probabilmente a causa dell'attività della fosfatasi alcalina endogena dai tubuli prossimali). Esperimenti di defosforilazione utilizzando la fosfatasi lambda su sezioni consecutive di paraffina-rene di topi C57BL/6 hanno ulteriormente confermato che il nuovo anticorpo riconosce solo NKCC2 fosforilato (Figura 5C). Inoltre, l'immunofluorescenza su criosezioni consecutive ha dimostrato che l'anticorpo colora solo la membrana plasmatica apicale dei TAL positivi per NKCC2- ma non dei DCT positivi per NCC nei topi 129Sv e C57BL/6 (Figura 5D), suggerendo che il nuovo L'anticorpo pNKCC2 non reagisce in modo incrociato con il pNCC. Questa conclusione è stata confermata anche utilizzando lisati cellulari da cellule MDCKI che esprimono NKCC2 umano (hNKCC2) e NCC umano (hNCC). Immunoblot di immunoprecipitazioni (IP) e lisati di cellule intere hanno dimostrato che il nuovo anticorpo pT96 NKCC2 riconosce l'NKCC2 umano ma non l'NCC umano (Figura S8A). È interessante notare che, sebbene il nuovo anticorpo sia stato sollevato contro pNKCC2 di topi C57BL/6, il nuovo anticorpo ha rilevato la fosforilazione di NKCC2 in modo equivalente nei reni di entrambi i ceppi di topo sia dall'immunoistochimica (Figura 6A) che dall'immunoblotting (Figura 6B).

Il nuovo anticorpo pT96 NKCC2 consente l'analisi della fosforilazione NKCC2 regolata

La fosforilazione e quindi l'attività di NKCC2 e NCC sono regolate da concentrazioni di ioni extracellulari. Un basso [Cl -] ex aumenta la fosforilazione di NKCC2 a Thr96 e Thr101 e di NCC a Thr53 e Thr58 tramite l'attivazione del percorso WNK/SPAK/OSR1. 7,8,18,29,35 Allo stesso modo, un alto [K plus ] diminuisce rapidamente la fosforilazione di NCC, ma si pensa che abbia poco o nessun effetto sulla fosforilazione di NKCC2. 12,36,37,38 Per verificare se l'anticorpo pT96 NKCC2 di nuova concezione è in grado di rilevare questo tipo di regolazione differenziale della fosforilazione di NKCC2,renefette di topi C57BL/6 sono state esposte ex vivo rispettivamente a 110 o 5 mM [Cl -] ex ea 3 o 10 mM [K plus ] ex. Come previsto, il basso [Cl -] ex ha fortemente aumentato la fosforilazione di NCC e NKCC2 (Figura 7A, B), mentre l'alto [K plus] ex ha solo ridotto la fosforilazione di NCC ma non ha alterato la fosforilazione di NKCC2 (Figura 7C, D). Allo stesso modo, il nuovo anticorpo è stato rilevato ugualmente ben alterato

FIGURA 4 Nessun cambiamento significativo nell'mRNA e nell'espressione proteica di majorrenaletrasportatori e canali ionici nella generazione F2 incrociata. A, Grafico a barre dei livelli di espressione relativi dell'mRNA nei tre gruppi di topi. Tutti i valori sono stati normalizzati a topi f/f. I valori sono mezzi ± SEM. B, Abbondanza proteica nel toporenelisati di animali della generazione F2. I tre gruppi corrispondono a NKCC2 a lunghezza intera (f/f), NKCC2 omozigote per la delezione (Δ/Δ) o NKCC2 eterozigoti per la delezione (f/Δ/). Sono inclusi i marcatori di peso molecolare. NKCC2 e pNKCC2 sono attesi a 170 kDa, NCC e pNCC a 130 kDa, TRPM6 a 260 kDa, - ENaC a 95 kDa e 34 kDa (clivato), - ENaC a 100 kDa, - ENaC a 100 kDa e 85 kDa (clivato) , ROMK a 55 kDa (glicosilato maturo), 43 kDa (glicosilato centrale) e 34 kDa (non glicosilato). Le frecce verdi indicano le bande specifiche mentre le punte delle frecce rosse indicano le bande non specifiche. C, Analisi densitometrica dell'abbondanza proteica confrontando topi f/f e Δ/Δ. Le intensità di banda dei topi Δ/Δ sono normalizzate a quelle di f/f. (I valori sono medie ± SEM; n=5 topi/gruppo; *P < .05,="" †="" p="">< .01,="" ‡="" p=""><>

Fosforilazione di NKCC2 che è stata provocata nelle cellule MDCKI che esprimono NKCC2 umano (hNKCC2) o NKCC2 di topo (mNKCC2(C57BL/6)) da condizioni ipotoniche di cloruro extracellulare basso (Figura S8B). Inrenefette incubate a 5 mM [Cl − ] ex , anche gli anticorpi anti-topo pT96/T101 NKCC2 39 precedentemente descritti e anti-umano pT212/T217 NKCC1 R{9}} rilevano deboli segnali per NKCC2 e NCC, che diventano più evidenti quando vengono caricate più proteine ​​​​e gli immunoblot vengono ripresi con impostazioni avanzate (Figura S9).

DISCUSSIONE

I topi C57BL/6 e 129Sv sono due dei ceppi di topi più comunemente usati per la ricerca biomedica. Il genoma dei topi C57BL/6 è stato il primo sequenziato per il topo 40 e da allora è servito come genoma di riferimento per l'analisi delle variazioni genetiche e fenotipiche tra ceppi di topo. 41- 44 Perrenericerca, una differenza essenziale tra i topi C57BL/6 e 129Sv riguarda l'espressione del gene della renina. Come gli esseri umani, i topi C57BL/6 ospitano un solo gene della renina, mentre i topi 129Sv ne possiedono due copie, il che potrebbe spiegare la maggiore suscettibilità di questo ceppo murino all'ipertensione 45,46 e al danno ipertensivo. 47 Con il presente studio, aggiungiamo un'altra importante differenza genetica che deve essere considerata. Descriviamo una delezione di cinque amminoacidi finora non apprezzata in NKCC2 (ΔF97- T101), presente in C57BL/6 ma non nei topi 129Sv, che interferisce con il rilevamento della fosforilazione di NKCC2 con la maggior parte degli anticorpi precedentemente disponibili, ma non in modo significativo impattofunzione renale.

I siti di fosforilazione N-terminale del topo NKCC2 T96 e T101 sono altamente conservati tra le specie e tra NKCC2, NKCC1 e NCC (Figura 1). 48 Pertanto, non sorprende che gli anticorpi diretti contro questi siti di fosforilazione reagiscano in modo incrociato con gli altri cotrasportatori. Studi precedenti hanno riportato che gli anticorpi contro l'NCC fosforilato rilevano anche l'NKCC fosforilato2 7,18,28,29 e che un anticorpo pNKCC1 consente l'analisi dei livelli di fosforilazione sia di NKCC1 che di NKCC2. 11 Coerentemente con questo, abbiamo osservato una reattività crociata dei nostri anticorpi pNCC (pT53 e pT58) con NKCC2 fosforilato e del nostro anticorpo NKCC2 pT96/pT101 con NCC fosforilato. Tuttavia, la reattività crociata degli anticorpi pNCC con NKCC2 è stata osservata solo nei reni dei topi 129Sv, ma non nei reni dei topi C57BL/6. Al contrario, il nostro anticorpo precedentemente sviluppato per NKCC2 pT96/pT101 non ha mostrato alcun segnale o al massimo molto debole per pNKCC2 nei reni dei topi C57BL/6 e ha rilevato NCC principalmente fosforilato in questo ceppo. Ora colleghiamo queste osservazioni confuse a una delezione di cinque amminoacidi in NKCC2 di topi C57BL6 (ΔF97- T101). La regolazione della fosforilazione di NKCC2 è stata studiata

ied in vari contesti sperimentali e per vari stimoli tra cui vasopressina, 14,21,24,25,49 uromodulina 19,20,50 e inibitori della calcineurina. 10,26 Mentre la maggior parte degli studi è stata eseguita in sistemi di espressione eterologhi 10,19,20,25,50 o in ratti 10,24 e topi 19,26 che esprimono NKCC2 a lunghezza intera, alcuni studi sono stati condotti anche in topi C57BL/6. 7,18,27,28,29,51 Come riportiamo qui, i topi C57BL/6 esprimono una variante NKCC2 con una delezione di cinque amminoacidi che interferisce con il corretto rilevamento della fosforilazione di NKCC2 e che comporta il rischio che lo standard pT96/T101 NKCC2 gli anticorpi e l'anticorpo R5 anti fosfo-NKCC1 reagiscono in modo incrociato con l'NCC fosforilato almeno nelle condizioni utilizzate nel nostro lavoro. Non è possibile giudicare l'impatto di questa reazione incrociata su precedenti conclusioni sperimentali, ma secondo le nostre osservazioni, i dati dei topi C57BL/6 dovrebbero essere rivisitati e interpretati con cautela. Nonostante il fatto che la delezione dei cinque amminoacidi abbia avuto un forte impatto sul rilevamento della fosforilazione di NKCC2, non abbiamo prove che la delezione influisca in modo significativo sull'attività funzionale del cotrasportatore. I topi C57BL/6 avevano infatti una maggiore escrezione urinaria di Mg 2 più e una minore escrezione urinaria di Ca 2 più 31 rispetto ai topi 129Sv, ma abbiamo scoperto che queste differenze probabilmente non sono correlate a un trasporto paracellulare alterato di questi cationi lungo il TAL, ma sono il risultato di un maggiore assorbimento di Mg 2 dipendente da TRPM6- nell'intestino e un maggiore riassorbimento di Ca 2 dipendente da TRPV5- più in DCT2 e CNT. Quest'ultimo provoca un bilancio positivo di Ca 2 più che può aiutare ad aumentare la bassa densità minerale ossea dei topi C57BL/6. La scoperta che i topi C57BL/6 e 129Sv mostrano lo stessorenalele risposte ai diuretici dell'ansa e tiazidici e alla restrizione idrica suggeriscono inoltre che la delezione di cinque aminoacidi in NKCC2 non compromette significativamente la funzione TAL. Soprattutto, i topi della generazione F2 di topi incrociati C57BL/6 e 129Sv hanno lo stessorenalefenotipo indipendentemente dal fatto che i topi esprimano NKCC2 o NKCC2 a lunghezza intera (f/f).

omozigote (Δ/Δ) per la cancellazione. Queste osservazioni nei topi sono coerenti con i precedenti dati funzionali provenienti da sistemi di espressione eterologhi. Mentre le mutazioni di singoli residui in NKCC1 (T217 nell'uomo, T211 nel topo) o NCC (T60 nell'uomo, T58 nel topo) aboliscono l'attività di questi cotrasportatori, mutazioni del corrispondente residuo in NKCC2 (T105 nell'uomo, T101 nel topo ) hanno un effetto piuttosto scarso o addirittura nullo sull'attività NKCC2 basale e stimolata. 35,52,53 Anche quando entrambi i residui di treonina in NKCC2 sono mutati in alanina, l'attività funzionale di NKCC2 raggiunge ancora circa il 70% dell'attività massima, 35 suggerendo che la fosforilazione di questi siti è indicativa ma non essenziale per l'attività di NKCC2.

I siti di fosforilazione sono spesso omologhi tra le proteine. Quindi, il problema della reattività crociata degli anticorpi specifici del fosfoformio non è unico per gli anticorpi diretti contro NCC fosforilato, NKCC2 e NKCC1, ma è stato segnalato anche per altre proteine ​​come le chinasi ciclina dipendenti 1 e 2 54 e le cellule extracellulari chinasi 1 e 2 regolate dal segnale. 55 Coerentemente, ogni volta che vengono utilizzati anticorpi specifici dello stato di fosforilazione, sono necessari rigorosi controlli sperimentali per confermare la specificità dei segnali rilevati. Ciò può includere (a) la conferma che l'anticorpo impiegato rilevi la proteina al peso molecolare previsto (immunoblotting) e/o alla localizzazione cellulare e subcellulare prevista (immunofluorescenza), (b) la verifica che l'anticorpo interagisca specificamente con l'epitopo fosforilato mediante utilizzando saggi di competizione con peptidi fosforilati e non fosforilati e (c) dimostrazione che

l'anticorpo è specifico per il fosfoformio confrontando campioni di tessuto fosforilato e defosforilato. Questi controlli potrebbero essere integrati da controlli genetici che includono il test di tessuti da animali knockout e/o cellule che esprimono in modo eterologo la proteina di interesse. Nel presente studio, abbiamo utilizzato gli approcci sopra menzionati per caratterizzare a fondo un nuovo anticorpo pT96 NKCC2 che rileva NKCC2 fosforilato inrenecampioni di topi C57BL/6 e 129Sv ugualmente bene. L'anticorpo è specifico per il fosfoformio e non mostra alcuna reattività crociata apparente con l'NCC fosforilato in nessuna delle condizioni testate. Utilizzando questo anticorpo abbiamo confermato che basse concentrazioni di cloruro extracellulare aumentano la fosforilazione di NKCC2 in questo sito, 7,8 mentre le concentrazioni extracellulari alterate di potassio non hanno un ruolo regolatorio significativo. 24 In conclusione, il nostro lavoro rivela una differenza di deformazione critica nella sequenza di amminoacidi del topo NKCC2 che influisce sul rilevamento e quindi sull'analisi della fosforilazione e regolazione di NKCC2. Un anticorpo pT96 NKCC2 di nuova concezione aggira questo avvertimento tecnico e consente un rilevamento affidabile della fosforilazione alterata di NKCC2 indipendentemente dal background genetico dei modelli murini. Inoltre, il nostro studio sottolinea ancora una volta che le differenze di background genetico devono essere considerate quando si analizzano i modelli murini.

MATERIALI E METODI

Animali,I topi maschi corrispondenti all'età ({0}} settimane) appartenevano a ceppi consanguinei 129S6/SvEvTac, C57BL/6J, di seguito indicati come 129Sv e C57BL/6, o un ceppo ibrido misto 129S/B6 nella generazione F2. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le leggi svizzere sul benessere degli animali e approvati dall'amministrazione veterinaria del Canton Zurigo, Svizzera (licenze: 141/2014, 185/2017 e 135/2018). I topi sono stati genotipizzati per l'eliminazione di 15 basi utilizzando la PCR standard con i primer forniti nella Tabella S3. L'NKCC2 a lunghezza intera (f/f) ha un prodotto PCR previsto di 87 bp mentre la sequenza NKCC2 eliminata (Δ/Δ) è prevista a 70 bp.

Elaborazione dei tessutiI topi sono stati anestetizzati con una combinazione di isoflurano (2 percento - 4 percento, 0,5 l/min; Provet; CH) e Temgesic (buprenorfina; 0.05- 0. 4 mg/kg di peso corporeo; Indivor; CH). Per l'analisi biochimica, i topi sono stati anestetizzati e perfusi attraverso il ventricolo sinistro del cuore con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). I reni e i due punti distali sono stati raccolti, congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi fino a un'ulteriore elaborazione. Per l'immunoistochimica, i reni sono stati fissati utilizzando paraformaldeide (PFA) al 3% in 0.1 M tampone fosfato (pH 7,4, 300 mOsm) mediante perfusione retrograda del topo profondamente anestetizzato tramite l'aorta addominale seguito da un breve risciacquo con 0.1 M tampone fosfato (0,2 M NaH 2 PO 4 x H 2 O, 0,2 M NaH 2 PO 4 x 2H 2 O, 0,1 M CaCl 2 ). Successivamente, i reni sono stati rimossi, tagliati a pezzi e congelati in propano liquido e conservati a -80 gradi.

Studi sulle gabbie metabolicheDopo l'adattamento alle gabbie metaboliche (Techniplast), i topi sono stati tenuti nelle gabbie metaboliche per quattro giorni consecutivi con libero accesso all'acqua del rubinetto e cibo da laboratorio standard (Ssniff, Spezialdiäten GmbH). Sono stati registrati quotidianamente il peso corporeo, l'assunzione di cibo e acqua e sono state raccolte le urine e le feci delle 24 ore.

Protocollo di restrizione idricaI topi sono stati tenuti per 24 ore in gabbie metaboliche (Techniplast) senza accesso all'acqua del rubinetto. La polvere da laboratorio standard (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) è stata miscelata con acqua 1:1, sono state raccolte e analizzate le urine delle 24 ore e le feci. Dopo 24 ore, i topi sono stati rimessi in gabbie normali (T 2L (IVC), LASC, UZH).

Misure biochimicheLe concentrazioni urinarie di Na plus , K plus , Ca 2 plus sono state analizzate mediante fotometria a fiamma (EFOX 5053, Eppendorf). Le concentrazioni urinarie e plasmatiche di Mg 2 plus sono state misurate presso il Centro di fisiologia integrativa dei roditori di Zurigo con uno o più sistemi SYNCHRON LX ® , UniCel ® DxC 800 Synchron ® Clinical System e Synchron ® System Multi Calibrator. La creatinina urinaria è stata misurata seguendo il metodo Jaffe. Le concentrazioni di gas nel sangue e di ioni sono state misurate nel sangue intero eparinizzato utilizzando l'analizzatore di gas nel sangue (radiometro) ABL825Flex subito dopo il prelievo di sangue dalla vena cava. I livelli plasmatici di aldosterone e la concentrazione urinaria di uromodulina (UMOD) sono stati misurati con kit ELISA disponibili in commercio (kit Aldosterone ELISA di Cayman; #501090 e kit Mouse Uromodulin ELISA di Abcam; ab245726 rispettivamente).

Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)

L'RNA è stato isolato dai reni e dal colon distale utilizzando il kit di isolamento dell'RNA totale SV (PROMEGA). Concentrazioni uguali di RNA isolato (250 ng in 129Sv vs C57BL/6 o 500 ng in f/f, Δ/Δ e f/Δ) sono state trascritte inversamente in cDNA con il kit GoScript™ Reverse Transcriptase (PROMEGA). I cDNA generati sono stati ulteriormente diluiti con acqua priva di DNAsi/RNAsi (1:5). I primer sono stati progettati per la quantificazione di Slc12a1, Slc12a3, Trpm6, Trpv5, Scnn1a, Scnn1b, Scnn1g e Kcnj1 totali (Tabella S3). L'analisi quantitativa della PCR è stata eseguita utilizzando LightCycler ® 480 (Roche) per misurare i livelli di espressione dei geni di interesse. L'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo delta Ct utilizzando -actina come gene di riferimento.

Analisi Western blotI reni sono stati omogeneizzati in un tampone di lisi privo di detersivo (DFLB) contenente mannitolo 200 mM, HEPES [4- (2- idrossiletile)- 1 piperazinetansolfonico acidi] 80 mM, idrossido di potassio 41 mM, inibitori della proteasi (Complete Ultra, Roche) e inibitori della fosfatasi (PhosSTOP, Roche) utilizzando 32 perline Magna Lyser Green (Roche) in un omogeneizzatore di tessuti Precellys 24 (Bertin Instruments, Montignyle- Bretonneux). Le perle sono state sedimentate mediante centrifugazione per 10 minuti (1987 rcf) e la proteina contenente il supernatante è stata conservata in aliquote monouso a -80 gradi. Per il Western blot, 50 µg di proteine ​​sono stati denaturati in Laemmli Buffer, separati mediante SDS-PAGE utilizzando gel all'8% - 12% e successivamente trasferiti su membrane di nitrocellulosa. I siti di legame non specifici sono stati bloccati utilizzando 1x Odyssey Blocking Solution (Li- COR Biosciences) prima che le membrane fossero incubate con anticorpi primari (Tabella S4) diluiti in 0,2x Odyssey Blocking Solution a 4 gradi per 12 ore. Dopo il lavaggio in PBS- 0.1% Tween, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari (colorante IR capra-anti-coniglio 800 o colorante IR capra-anti-topo 680, 1:10'000, LI - COR Biosciences) diluito in tampone Casein Blocking 0,1x (Sigma). Le bande rilevate sono state visualizzate con il sistema di imaging a infrarossi Odyssey (Li- COR Biosciences). Per garantire un carico proteico uguale, le membrane sono state co-colorate con un anticorpo contro l'actina o la proteina totale è stata colorata utilizzando il colorante proteico totale REVERT (Li- COR Biosciences) prima del rilevamento degli anticorpi. Le bande immunoreattive sono state quantificate nelle Fiji (ImageJ) e normalizzate rispettivamente contro il segnale di actina o la colorazione della proteina totale REVERT.

ImmunoistochimicaLe sezioni del criostato (spessore 4 µm) sono state bloccate per il legame di anticorpi non specifici con il 10% di siero di capra normale e successivamente incubate con anticorpi primari (Tabella S4)

pernottamento a 4 gradi. Dopo il lavaggio con 1X PBS, i vetrini sono stati incubati con anticorpi secondari (Cy3 – IgG coniugato di capra-anti-coniglio, codice prodotto 111- 165- 144, 1:1000 e FITC – IgG coniugato di capra-anti-topo , numero prodotto 115- 095- 068, rispettivamente 1:100, entrambi dei Jackson Immuno Research Laboratories) per 2 ore a temperatura ambiente. Tutti gli anticorpi sono stati diluiti in BSA/1xPBS all'1%. I nuclei cellulari sono stati colorati con DAPI (4',6- Diamidino- 2- fentilindolo, Sigma-Aldrich, Co.) a una concentrazione di 0,1 µg/mL. L'imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio a fluorescenza Leica DM6000 B (Leica Microsystems, 35578) con una fotocamera digitale monocromatica a fluorescenza Leica DFC350 FX (Leica Microsystems, 35578). Le immagini sono state elaborate alle Figi (ImageJ).

Generazione di anticorpi purificati per affinità coniglio-anti-topo pT96 NKCC2La produzione di anticorpi è stata eseguita dal servizio anticorpale Pineda (Berlino, Germania). I conigli sono stati immunizzati con un fosfopeptide comprendente gli amminoacidi 105- 114 della sequenza NKCC2 di topo C57BL/6 (NH2- YYLQ(p) TMDAV-COOH). La frazione di IgG monospecifica è stata purificata per affinità contro il fosfopeptide e successivamente preassorbita con il defosfopeptide risultando in una frazione anticorpale specifica per il fosfoformio. La specificità dell'anticorpo di questa frazione è stata testata mediante immunoistochimica e analisi Western blot (Figura 5 e Figura S4).

Trattamento con fosfatasiI lisati proteici sono stati incubati per 1 ora a 37 gradi con fosfatasi alcalina intestinale di vitello (CIAP) (1 U/1 µg di proteina) per indurre l'idrolisi dei gruppi 5′-fosfato di proteine ​​fosforilate, che hanno inibito il legame specifico del pT96 Anticorpo NKCC2 alle proteine ​​sulla membrana Western blot di nitrocellulosa (Figura 5B). Sono stati utilizzati reni inclusi in paraffina archiviati da topi C57BL6. Il trattamento delle sezioni con fosfatasi alcalina intestinale di vitello (Sigma Aldrich) è stato eseguito come descritto in precedenza con lievi modifiche. 56 Dopo il blocco dei gruppi aldeidici liberi, le sezioni sono state risciacquate cinque volte in tampone fosfatasi alcalina (100 mm Tris, 50 µm CaCl 2 , 0,1 mm MgCl 2 , 8,4 µm leupeptina, 4 mm Pefablock, pH 9,0). Successivamente, le sezioni sono state incubate in tampone di fosfatasi alcalina con o senza fosfatasi alcalina intestinale di vitello (~130 unità/mL) in un'incubatrice a 35 gradi per 2 ore. L'immunoistochimica e la microscopia ottica sono state successivamente eseguite come dettagliato. 57

Allineamento della sequenza degli amminoacidiLe sequenze di amminoacidi per diverse specie e ceppi di topo sono state ottenute dal database aperto "Ensembl Genome Browser" (www.ensem bl.org, Sanger Institute). 42 Le fonti degli ID trascrizione sono elencate nella Tabella S1. Le sequenze sono state allineate utilizzando Qiagen © CLC Main Workbench 20.

Fette di reneRenefette di topi C57BL/6 sono state utilizzate per esperimenti ex vivo come descritto in precedenza. 12 In breve, i topi sono stati lasciati a digiuno durante la notte con libero accesso all'acqua per evitare qualsiasi potenziale effetto dell'assunzione di ioni nella dieta sui livelli di fosforilazione di NKCC2 e NCC. I reni sono stati rimossi da animali anestetizzati, tagliati a fette spesse 280 µm utilizzando un microaffettatore vibrante (Vibratome, Microm; Thermo Scientific) e posti in una soluzione di Ringer (in mM): 98,5 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 1 Na 2 HPO 4 , 2,5 CaCl 2 , 1,8 MgCl 2 e 25 glucosio per 30 minuti a 30,5 gradi con gorgogliamento costante con il 95 percento di O 2 e il 5 percento di CO 2 . Successivamente, la soluzione di Ringer è stata sostituita da soluzioni simili ma con diverse concentrazioni di Cl − (5 mM per Cl basso − , 110 mM per Cl normale − ) e K plus (3 mM per K plus normale , 10 mM per K plus alto ) per ulteriori 30 minuti. Infine, le fette sono state congelate a scatto in azoto liquido.

StatisticheIl test t di Student non accoppiato e il test di Welch nel caso di varianze disuguali sono stati utilizzati per confrontare due gruppi (GraphPad Prism, versione 8.0.2). Per il confronto multiplo, è stata eseguita l'ANOVA unidirezionale o bidirezionale seguita dal post-test di confronto multiplo di Tukey (GraphPad Prism, versione 8.0.2). I dati vengono visualizzati come mezzi ± SEM (in tabelle e figure). Le differenze sono state considerate significative quando P <>

RINGRAZIAMENTI  Gli autori ringraziano il dottor Gary Shull (Università di Cincinnati, Cincinnati, OH) per aver fornito i topi NCC-KO, il dottor Biff Forbush (Yale School of Medicine, New Haven, CT) per il suo anticorpo "R5" pNKCC1 e il dottor Henrik Dimke ( University of Southern Denmark, Odense, Danimarca) per il suo anticorpo monoclonale NCC totale di topo. Gli autori riconoscono anche Monique Carrell e Inger Merete Paulsen per l'assistenza tecnica e il dottor Eszter Banki per la forniturarenecampioni. Le misurazioni della densità minerale ossea e parte dell'analisi delle urine e del plasma sono state eseguite rispettivamente dalla dott.ssa Petra Seebeck e Nadine Nägele (Zurich Integrative Rodent Physiology, Università di Zurigo). Molto apprezzato è stato il contributo molto utile della dott.ssa Alicia McDonough (Università della California meridionale) e del dott. Olivier Devuyst (Università di Zurigo).

CONFLITTO D'INTERESSE Il gruppo di JL riceve le royalties per gli anticorpi concessi in licenza contro NCC e Nedd fosforilato4- 2 rispettivamente da Milipore e Abcam. Entrambi gli anticorpi non sono stati utilizzati nel presente studio. Inoltre, JL ha ricevuto nel 2019 un onorario da VIFOR per una presentazione orale a un simposio organizzato da VIFOR.