Impronte digitali HPLC e relazione effetto spettro-antitumorale per la discriminazione tra Mylabris Phalerata Pallas e Mylabris Cichorii Linnaeus

Contatto: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 Scuola di Farmacia, Zunyi Medical University, Zunyi, Cina,

2 Laboratorio chiave di farmacologia di base del Ministero dell'istruzione e Laboratorio di ricerca internazionale congiunto di etnomedicina del Ministero dell'istruzione, Università medica di Zunyi, Zunyi, Guizhou, Cina.

3 School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi, Cina, 4Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi, Cina.

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Mette in risalto

Questo studio fornisce un metodo HPLC applicabile, credibile e più efficiente per discriminare due specie di Mylabris. E, il fingerprinting HPLC e lo spettro-effetti antitumoralisono stati integrati e sono stati trovati i tre importanti marcatori differenziali per un nuovo marcatore di Mylabris.

Astratto

Obiettivo: Valutazione della discriminazione tra due specie Mylabris basata su fingerprinting HPLC e spettro-effetto antitumoralerelazione. Metodi: In questo studio, un metodo di cromatografia liquida (HPLC) ad alte prestazioni semplice ed efficiente che si integra con l'analisi chemiometrica e spettro-effetto antitumoraleè stata sviluppata una relazione per la discriminazione tra due specie di Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) e Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Risultati: nell'analisi delle impronte digitali, sono stati selezionati 14 picchi caratteristici per valutare le differenze tra MP e MC utilizzando l'analisi di somiglianza e riconoscimento del modello utilizzando PCA e OPLS-DA. I cromatogrammi HPLC di campioni provenienti da 10 regioni della Cina hanno mostrato differenze tra MP e MC e sono stati trovati 7 marcatori chimici caratteristici. Nello spettro-effetto antitumoraleanalisi delle relazioni, 4 marcatori di attività hanno svolto un ruolo fondamentale nella diminuzione dell'IC50 e potrebbero essere i componenti antitumorali di Mylabris mediante l'analisi relazionale grigia e l'analisi di regressione lineare multivariata. L'analisi chemiometrica in combinazione con i risultati della relazione spettro-effetto ha indicato che i picchi 2 (citosina), 4 (sconosciuto) e 14 (sconosciuto) erano importanti marcatori differenziali per distinguere le due specie di Mylabris.

Conclusione: il metodo è applicabile, credibile e più efficiente per discriminare MP e MC e offrirà un nuovo modo per facilitare il controllo di qualità dei medicinali per insetti.

Parole chiave: HPLC, impronta digitale, spettro-effetto antitumorale, Mylabris, Discriminazione

Sfondo

Mylabris, chiamato ban mao in Cina, è stato usato come medicina tradizionale cinese (MTC) per il trattamento di foruncoli, ulcere profonde, una massa addominale ed è un importanteantitumoraleagente. Inoltre, è ampiamente usato in Europa come medicina popolare [1]. Il principale costituente attivo di Mylabris è la cantaridina, che è un efficaceantitumoralecomposto [2]. Moderni studi farmacologici hanno dimostrato che Mylabris possiede molteplici attività ed è molto apprezzato per il trattamento dei tumori a causa del suo dupliceanticancroproprietà e la capacità di aumentare il numero di leucociti [3-4]. Allo stato attuale, Mylabris è stato ampiamente utilizzato in alcune prescrizioni cliniche di MTC anti-carcinoma in Cina, come l'iniezione di Aidi e la capsula Compound Ban Mao.

Secondo la Farmacopea della Repubblica popolare cinese (versione 2015), Mylabris è definito come un corpo essiccato di Mylabris phalerata Pallas (MP) e Mylabris cichorii Linnaeus (MC), che differiscono per caratteristiche botaniche, dinamiche di popolazione ed ecologia [ 5-6]. Mylabris è anche un farmaco altamente tossico. Poiché i farmaci disponibili in Cina sono solitamente una miscela di MP e MC, è necessario identificare le differenze chimiche e di attività tra le due specie.

Poiché i MTC contengono numerosi ingredienti noti e sconosciuti, l'analisi del profilo quantitativo dei loro costituenti chimici rappresenta una sfida significativa. Il fingerprinting mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) svolge un ruolo importante nel controllo di qualità (QC) della TCM a causa delle caratteristiche generali del profilo della maggior parte dei composti in un sistema complesso. Inoltre, l'analisi delle impronte digitali delle MTC ha una buona riproducibilità e stabilità per l'autenticazione delle specie e la valutazione della qualità ed è accettata dall'Organizzazione mondiale della sanità, dalla State Food and Drug Administration of China (SFDA) e dall'Agenzia europea di valutazione dei medicinali (EMEA). Recentemente, è stata sviluppata un'analisi chemiometrica che combina il fingerprinting HPLC per il controllo di qualità e per discriminare diverse fonti naturali complesse [7]. Tuttavia, è inefficace discriminare le differenze nelle MTC poiché non può riflettere le differenze dei costituenti attivi, che è più importante per l'uso clinico. Finora, spettro-antitumorale effettoapprocci di relazione sono stati utilizzati per identificare con successo i costituenti bioattivi delle MTC [8]. L'impronta digitale HPLC combinata con l'analisi chemiometrica e la relazione spettro-effetto antitumorale chiarirà meglio la differenza di più fonti di MTC.

Recentemente sono stati riportati alcuni metodi per determinare il contenuto di cantaridina, che possono essere utilizzati per determinare la qualità di Mylabris [9]. Alcune impronte digitali cromatografiche sono state applicate anche per il controllo qualità [10-11]. Solo uno studio ha utilizzato un metodo che prevede un'eluizione a gradiente dei composti idrosolubili di Mylabris basato su HPLC. Nel frattempo, sono stati utilizzati solo dieci campioni e nessun campione MC [12]. Per quanto ne sappiamo, la discriminazione di MP e MC in base alla composizione chimica e all'attività non è stata studiata prima.

Questo studio mirava a sviluppare un metodo semplice ed efficiente per discriminare due specie di Mylabris utilizzando il fingerprinting HPLC combinato con l'analisi chemiometrica e spettro-antitumoraleeffettorelazione, che fornirà una base per il QC di Mylabris. Questo metodo potrebbe essere applicato anche per identificare il marcatore QC di altri MTC.

Materiali e metodi

In totale, 20 lotti di Mylabris phalerata Pallas (MP) e Mylabris cichorii Linnaeus (MC) sono stati raccolti da diverse province della Cina (Tabella 1) e identificati dal nostro prof Xiao-Fei Li. I campioni di voucher sono stati depositati nei nostri laboratori.

Lo standard di riferimento citosina, uridina, guanosina e adenosina sono stati acquistati da ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Cina). L'acetonitrile e il metanolo di grado HPLC sono stati acquistati da Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, USA). L'acqua pura di Watson è stata utilizzata durante lo studio. Altre sostanze chimiche e solventi erano di grado analitico e ottenuti da Aladdin Reagent (Shanghai, Cina), Chengdu Kelong Reagent (Chengdu, Cina) e Sinopharm Chemical Reagent (Pechino, Cina)

Apparecchiatura e condizioni cromatografiche

L'analisi HPLC è stata condotta utilizzando un sistema HPLC Agilent 1260 Infinity a 30 gradi su un Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) per il rilevamento delle impronte digitali. Per la separazione è stata utilizzata l'eluizione in gradiente lineare con gli eluenti A (acqua/acido acetico glaciale, 100:1, v/v) e B (metanolo). Il programma del gradiente è stato sviluppato come segue: 0-1 min, 3,{12}},6 percento B; 1-9 min, 4,6-6,8 percento B; 9-25 min, 6.{20}},0 percento B; 25-30 min, 51.{24}} percento . La portata della fase mobile era di 1,0 mL/min. Il cromatogramma è stato monitorato a 254 nm. Dopo un periodo di equilibrazione di 15 minuti, sono stati utilizzati 10 μL di campioni per l'iniezione.

preparazione del campione

I campioni essiccati sono stati frantumati in polvere e 2,5 g di ciascun campione in polvere sono stati estratti due volte con 50 ml di etanolo al 75% mediante riflusso per 1,5 ore ogni volta. Il campione estratto è stato miscelato e concentrato a pressione ridotta a 20 mL. La miscela è stata quindi precipitata con 80 mL di acqua per 24 ore a 4 gradi. Successivamente, l'estratto è stato centrifugato a 3000 g min-1 per 10 minuti per separare il supernatante. Il supernatante è stato concentrato a pressione ridotta a 25 mL. Infine, il supernatante è stato filtrato attraverso un film Millipore da 0,22 μm prima dell'analisi HPLC.

Convalida della metodologia

Il metodo HPLC è stato convalidato per precisione, riproducibilità e stabilità (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h). La convalida è stata stimata in base al tempo di ritenzione (RT) e all'area di picco (PA). Infine, sono state stabilite le impronte chimiche di 20 lotti di Mylabris per identificare le caratteristiche chimiche integrate di più composti. Alcune tecniche chemiometriche sono state introdotte sull'impronta chimica per l'analisi.

Analisi del riconoscimento del modello

Le differenze tra due specie delle aree di picco sono state valutate per la significatività statistica utilizzando il test t di Student spaiato. Un valore p inferiore a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Come metodo classico non supervisionato, l'analisi delle componenti principali (PCA) è ampiamente applicata per l'analisi dei dati statistici. Invece di utilizzare molte variabili, PCA prende un piccolo numero di PC senza perdere molte informazioni e vengono quindi visualizzati i grafici dei punteggi per la libera separazione delle osservazioni. In questo studio, la PCA è stata condotta sulle aree di picco normalizzate di ciascun componente nelle impronte digitali HPLC utilizzando il software SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics, Umea, Svezia) per trovare la discriminazione tra le due specie di Mylabris.

Per una discriminazione più preferita tra le due specie di Mylabris, è stato applicato un metodo supervisionato di analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA) per analizzare le differenze nelle aree di picco normalizzate di ciascun componente nelle impronte HPLC. Il valore VIP è una somma ponderata dei quadrati dei pesi OPLS, che riflette il contributo relativo di ciascuna variabile X al modello. Le variabili con VIP > 1, insieme a S-plot, sono state considerate influenti per la separazione dei campioni nei grafici di punteggio generati dall'analisi OPLS-DA. Quindi, sono stati ottenuti i caratteristici marcatori chimici per la discriminazione.

Analisi del rapporto spettro-effetto antitumorale

Per esplorare ilantitumoralearea del picco di effetto per i campioni Mylabris integrati con i dati dell'impronta digitale e confrontare le differenze tra le due specie, la correlazione tra il picco dell'impronta eanti-tumoresono stati studiati gli effetti. Due metodi che combinano l'analisi relazionale grigia e l'analisi di regressione lineare multivariata (MLRA) sono stati applicati da SPSS19.0 (IBM, USA) e GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, Cina). Ilanti-tumoreil test è stato eseguito con i nostri metodi pubblicati [12], le cellule HepG2 della linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano sono state mantenute in terreno RPMI1640 integrato con il 10% di siero bovino fetale. Le cellule sono state coltivate in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 a 37 C. Il metodo SRB è stato utilizzato per valutare la proliferazioneanti-tumoreattività, quindi è stato calcolato l'IC50 delle cellule HepG2, infine, l'IC50 e le aree di picco normalizzate sono state utilizzate per l'analisi chemiometrica. Successivamente sono stati ottenuti i caratteristici marker di attività di Mylabris.

Risultati e discussione

Ottimizzazione delle condizioni di estrazione

Per un'estrazione sufficiente di composti di soluto d'acqua da Mylabris, il sistema di estrazione è stato ottimizzato. Gli ultrasuoni e il riflusso hanno mostrato che questi composti potevano essere estratti in modo ottimale mediante riflusso.

Ottimizzazione del metodo HPLC

Per ottenere picchi cromatografici massimi per descrivere la caratteristica generale dell'erba, sono state studiate la composizione della colonna cromatografica, la fase mobile e le lunghezze d'onda di rilevamento (200, 254, 265 e 278 nm). I risultati hanno mostrato che la colonna Phenimenex Synergy Polar-RP80, acqua (contenente l'1% di acido acetico glaciale) e metanolo e 254 nm erano le condizioni migliori per l'analisi HPLC Mylabris (Figura 1), la struttura di 4 sostanze standard è mostrata nella Figura 2 .

Convalida del metodo

In questo studio, 14 picchi erano ben separati e usati come "picchi comuni". La precisione, la ripetibilità e la stabilità erano basate sul tempo di ritenzione (RT) e sull'area del picco (PA). I valori RSD di RT e PA per la precisione (n=6) non hanno superato il 0.2 e il 4 percento, rispettivamente; I valori RSD di RA e PA per la ripetibilità (n=6) erano inferiori a 0,2 e 4 percento, rispettivamente, e i valori RSD per la stabilità (0-24 h) erano inferiori a { {10}},4 e 5% rispettivamente, che indicavano che i campioni erano stabili entro 24 ore. Questi risultati hanno dimostrato che la qualità dei campioni studiati e il metodo HPLC erano stabili e ben controllati.

Valutazione della somiglianza delle impronte digitali

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921 ad eccezione dei campioni MC (da Guizhou2 e Guizhou4), le cui somiglianze erano rispettivamente 0.888 e 0.887. Questi dati indicavano che la qualità di Mylabris all'interno di una specie era stabile. Tuttavia, le somiglianze di soli tre campioni MP rispetto all'impronta digitale HPLC di riferimento erano > 0.930; e le somiglianze di soli due campioni MC rispetto all'impronta digitale HPLC di riferimento erano > 0,921. Questi risultati hanno mostrato che le due specie di Mylabris presentavano variazioni considerevoli in alcune aree di picco.

Discriminazione di MP e MC mediante analisi di riconoscimento del modello

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, i picchi 1, 2, 4, 7, 9, 12 e 14 potrebbero essere le variabili più significative nella discriminazione tra le due specie (Figura 6). Il gruppo di picco (1, 2, 4, 7, 9, 12 e 14) può svolgere un ruolo fondamentale nel distinguere tra MP e MC come marcatori chimici caratteristici.

Relazione spettro-effetto mediante analisi relazionale grigia

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Relazione effetto spettro di MLRA

Il modello MLRA è il metodo di modellazione più comune per dedurre la complessità della relazione tra due o più variabili e una risposta che è stata costruita dalla seguente formula

Dove Y è il valore stimato e rappresenta la risposta; Xn è una variabile indipendente, b{{0}} è l'intercetta e bn è il coefficiente di regressione per Xn. In questo studio, MLRA è stato applicato per stabilire la relazione di efficacia delle impronte digitali tra i valori delle aree di picco nelle impronte digitali HPLC e l'IC50 di anti-HepG2, e quindi trovare i possibili componenti antitumorali. La collineazione dei dati è stata trovata da un modello MLRA comune, che non è adatto per esplorare la correlazione tra Y (IC50) e X (PA). Un modello PCA MLRA è stato utilizzato per studiare la relazione effetto-impronta digitale e per l'analisi sono stati selezionati i primi sei PC con un tasso di contribuzione della varianza cumulativa: 91,068%. Infine, in base all'output SPSS e ai PC è stata stabilita la seguente equazione: IC50=1.115864 plus （ 1.87268PA1- 699.722PA2 plus 25.7138PA3 - 24.1528PA4 plus 7.22878PA{{ 23}}.2114PA6 più 2.95283PA7- 15.5305PA8 più 13.0297PA9 più 22.5683PA10 - 10.3462PA11 più 123.762PA12 più 31.0428PA13 - 10.702PA14) ×10-6. (R era 0,682, P <>

Analisi integrativa di due specie Mylabris

L'esperimento ha mostrato che l'impronta digitale HPLC potrebbe essere utilizzata per riflettere le caratteristiche chimiche di Mylabris. Gli algoritmi di somiglianza, PCA e OPLS-DA sono stati applicati per trovare la differenza tra MC e MP. Il gruppo di picco (1, 2, 4, 7, 9, 12 e 14) è stato definito come marcatori chimici caratteristici.

Inoltre, sia GRA che MLRA si sono rivelati metodi soddisfacenti per ulteriori discriminazioni. Integrando i risultati dell'analisi GRA e MLRA, i picchi 2, 4 e 14 come marcatori di attività di Mylabris dovrebbero essere responsabili dell'effetto antitumorale, che potrebbe essere la base materiale farmacodinamico di Mylabris.

Gli importanti marcatori differenziali sono stati definiti per il picco con proprietà chimiche caratteristiche e marcatore di attività. Quindi, tra MC e MP sulle impronte digitali HPLC dopo l'analisi della relazione effetto spettro, i picchi 2 (citosina), 4 (sconosciuto) e 14 (sconosciuto) erano importanti marcatori differenziali per le differenze tra MP e MC come mostrato nella Figura 7.

Conclusione

In conclusione, nella presente ricerca, è stato proposto un metodo HPLC per il fingerprinting chimico di MP e MC. Combinando l'impronta digitale HPLC, la PCA e l'analisi della relazione effetto spettro come GAS e MLRA, è possibile discriminare le proprietà chimiche e farmacologiche di due specie vicine di Mylabris. Ciò indicava che i composti dei picchi 2 (citosina), 4 (sconosciuto) e 14 (sconosciuto) come importanti marcatori differenziali giocavano un ruolo dominante nel distinguere tra MP e MC. La struttura dei picchi 4 e 14 dovrebbe essere identificata da altre tecnologie. Il metodo dell'impronta digitale HPLC combinato con l'analisi statistica, chemiometrica e l'analisi della relazione spettro-effetto si è dimostrato efficiente nella scoperta dei componenti del marcatore o per la promozione del QC dierbe medicinali.

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